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Decisiones

Diagnóstico Detección

Investigación

Terapia

Reacción en Cadena de la Polimerasa


PCR

Blga. Milagros Huichi Atamari


PCR

• La reacción en cadena de la polimerasa, conocida


como PCR, es una técnica de biología
molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,

•  Su objetivo es obtener un gran número de copias de un


fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en
teoría basta partir de una única copia de ese fragmento
original.
PCR
Replicación de ADN
REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
SIMILAR

• Amplificación enzimática de un fragmento de DNA


• (simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades

• La hebra nueva de DNA se sintetiza en dirección 5’ 3’

• Las DNA polimerasas además de la hebra molde,


necesitan un iniciador (primer o cebador de extensión)

• La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA-


dependiente.
• Componentes
– desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs)
 dATP, dTTP, dGTP, dCTP

– Enzima  Taq Polimerasa (Thermus aquaticus)

– Iniciadores (Primers)  Complementarios a la cadena de


ADN

– ADN molde  Concentración de 20ng


Ciclador térmico
ADN polimerasa

Estable a altas
temperaturas
Thermus
aquaticus Enzima de 95kd.

Actividad
Exonucleasa: 5’—3’

Actuaaltas temperaturas
PRIMERS
(Iniciadores, Cebadores)
Dos oligonucleótidos que Únicos: Asegura alta especificidad:
son complementarios a
cada una de las dos hebras
5’ 3’
del ADN.
5’ 3’
5’
3’
3’ 5’

3’
5’

La secuencia del extremo 3’ es critica para el


funcionamiento
Tamaño

• Efectos en:

– tamaño 15 – 30 pb

– No debe formar dimeros

– Temperatura de aliniamiento entre 52C° -65C°


Par de“primers”
específicos

ADN Polimerasa
ADN

Buffer
MgCl2

dH2O
dCTP ultrapura
dATP
Desoxiribonucleótidos
dTTP
dGTP
Etapas de la PCR

1. Desnaturalización: Apertura de la doble cadena


2. Alineamiento: Anillaje de primers
3. Extensión: Generación de la nueva cadena
25-30 ciclos
Desnaturación Desnaturación
100
Temperatura

94 oC Extension 94 oC
72 oC
50 50-60oC
Anillaje

Tiempo
PCR
Temperatura
Desnaturalización
100
94 oC

50

0
Tiempo

3’ 5’
DNA de 5’ 3’
cadena doble
PCR
Temperatura
Desnaturación
100
94 oC

50

0
Tiempo
3’ 5’

DNA de
cadena simple
Calor

5’ 3’
PCR
Temperatura
Desnaturación Desnaturación
100
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

Hibridación
de primers

5’
5’ 3’
PCR
Temperatura
100
Desnaturación 30 ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 o
C
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’

Calor
5’

5’

Calor
5’
5’ 3’
PCR

Temperatura
100
Desnaturación 30ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

5’
5’

5’
5’

5’
5’ 3’
PCR

Temperatura
100
Desnaturación 30ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extensión
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’
5’ 3’

Calor
5’

5’

Calor
5’
PCR
Temperatura
100
Desnaturación 30ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’

5’
5’

5’
5’
PCR

Temperatura
100
Desnaturación 30ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
5’
5’

5’
5’
El numero de copias del DNA delimitado por los primers
se duplica en cada ciclo de PCR.

Numero de copias
1 2 4 8 16 32 64

0 1 2 3 4 5 6
# ciclos
Sondas de Hidrólisis: Sondas Taq Man

• La sonda se hibrida con el amplicón blanco.


• Se encuentra bloqueada en el extremo 3´(fosforilada, no puede ser
amplificado por la polimerasa).
• Tiene dos colorantes fluorescentes unidos (R= reportero y Q= quencher).
• El Q reduce la intensidad de fluorescencia del reportero cuando la sonda
está intacta.
Sondas de Hidrólisis: Sondas Taq Man
• Método consiste de 2 primers y dos sonas específicas de secuencia.

Desnaturalización

Pegado de primers y sondas

Extensión por la ADN Polimerasa

Extensión por la ADN Polimerasa y clivaje del Reportero

Fluorescencia
Molecular Beacons
• Es una sonda en horquilla.
• Tiene una región específica de secuencia flanqueada por dos repeticiones
invertidas.
• .
PCR en Tiempo Real
• Cuanto mayor cantidad de ADN inicial, habrá un
aumento más rápido de la señal fluorescente,
resultando en un Ct más bajo.

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