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Diagnóstico Detección
Investigación
Terapia
Estable a altas
temperaturas
Thermus
aquaticus Enzima de 95kd.
Actividad
Exonucleasa: 5’—3’
Actuaaltas temperaturas
PRIMERS
(Iniciadores, Cebadores)
Dos oligonucleótidos que Únicos: Asegura alta especificidad:
son complementarios a
cada una de las dos hebras
5’ 3’
del ADN.
5’ 3’
5’
3’
3’ 5’
3’
5’
• Efectos en:
– tamaño 15 – 30 pb
ADN Polimerasa
ADN
Buffer
MgCl2
dH2O
dCTP ultrapura
dATP
Desoxiribonucleótidos
dTTP
dGTP
Etapas de la PCR
94 oC Extension 94 oC
72 oC
50 50-60oC
Anillaje
Tiempo
PCR
Temperatura
Desnaturalización
100
94 oC
50
0
Tiempo
3’ 5’
DNA de 5’ 3’
cadena doble
PCR
Temperatura
Desnaturación
100
94 oC
50
0
Tiempo
3’ 5’
DNA de
cadena simple
Calor
5’ 3’
PCR
Temperatura
Desnaturación Desnaturación
100
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC
0
Tiempo
3’ 5’
5’
Hibridación
de primers
5’
5’ 3’
PCR
Temperatura
100
Desnaturación 30 ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 o
C
50 50 oC
0
Tiempo
3’ 5’
Calor
5’
5’
Calor
5’
5’ 3’
PCR
Temperatura
100
Desnaturación 30ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC
0
Tiempo
3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’ 3’
PCR
Temperatura
100
Desnaturación 30ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extensión
Primers 72 oC
50 50 oC
0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’
5’ 3’
Calor
5’
5’
Calor
5’
PCR
Temperatura
100
Desnaturación 30ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC
0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
PCR
Temperatura
100
Desnaturación 30ciclos
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC
0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’
5’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
5’
5’
5’
5’
El numero de copias del DNA delimitado por los primers
se duplica en cada ciclo de PCR.
Numero de copias
1 2 4 8 16 32 64
0 1 2 3 4 5 6
# ciclos
Sondas de Hidrólisis: Sondas Taq Man
Desnaturalización
Fluorescencia
Molecular Beacons
• Es una sonda en horquilla.
• Tiene una región específica de secuencia flanqueada por dos repeticiones
invertidas.
• .
PCR en Tiempo Real
• Cuanto mayor cantidad de ADN inicial, habrá un
aumento más rápido de la señal fluorescente,
resultando en un Ct más bajo.