ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

Dra. María Mercedes Soberón Lozano

 CONTENIDO
• Unidades de medida de la Actividad
Enzimática.
• Medida de la Actividad Enzimática.
• Métodos de Punto Final.
• Métodos de Puntos Múltiples.
• Métodos Cinéticos

• Enzimas como reactivos analíticos para la

determinación de metabolitos.
• Usos de las enzimas en el Laboratorio
Clínico.
 ¿Por qué las
enzimas pueden
ser útiles en un
diagnóstico
clínico?
 Enzimas
presentes
en todas
las
células de
los
tejidos
Factores de coagulación (enzimas), son específicas
del plasma sanguíneo
NORMALMENTE, están en concentraciones
significativas
 ¿ Qué se tiene en
cuenta para elegir a
una enzima como
herramienta de
diagnóstico?

1. Distribución
2. Localización celular
3. Tiempo vida media
 Clasificación de Bücher
Grupos Enzima
Protrombina
Plasminógeno
Específicas del Ceruloplasmina
plasma Lipoproteinlipasa
pseudocolinesterasa

Amilasa pancreática
Amilasa salival
De secreción Fosfatasa prostática
Pepsinógeno
LDH, MDH, Glicerol-3-P
Deshidrogenasa; 1,6
De vías principales difosfo-fructo-aldolasa;
Celulares GOT; GPT.
Organoespecíficas Enz del ciclo de la urea;
glucosa-6-fosfatasa; 5´ND.
 Enzimas Plasmoespecíficas

Su lugar de acción es en el plasma.

Sintetizadas en determinados tejidos
(mayoría en hígado) y vertidas a la sangre
activamente, lugar de acción, donde se
encuentran su sustrato y coenzima.

Disminución de su actividad (normalmente

alta en suero) indica una alteración en la
síntesis de la enzima y funcionalidad
hepática.
 Enzimas secretadas o exocitoenzimas

Secretadas por glándulas ó tejidos muy

especializados.

Su lugar de acción está alejado.

- Enzimas digestivas del páncreas y

que van al duodeno a ejercer su acción
(amilasa, lipasa, tripsina, etc.).

Clínicamente, estas enzimas en sangre están

en baja actividad.
Enzimas secretadas o exocitoenzimas

Aumentarían sus niveles en:

- patología aguda (pancreatitis).

- patología crónica, donde la glándula

está hipofuncionante, por lo que su
actividad enzimática estaría disminuída en
el lugar de acción (duodeno).
Enzimas celulares o endocitoenzimas

Tienen su lugar de acción dentro de

la misma célula que las sintetiza, no
tienen acción en plasma por falta de
sustrato y de coenzima.
Enzimas celulares o endocitoenzimas
1. De vías principales
Todas las que intervienen en el
metabolismo general
LDH,
MDH,
ALT o Alanina-aminotransferasa,
AST o Aspartato-aminotransferasa.

2. Organoespecíficas
Enzimas especificas de determinados
órganos ó tejidos que actúan en procesos
metabólicos específicos de ciertos tejidos.
Enzimas celulares o endocitoenzimas

Enzimas Uniloculadas. Su ubicación es

totalmente citoplasmática

- GPT (glutámico-pirúvico
transaminasa)
- LDH (láctico deshidrogenasa).
Enzimas celulares o endocitoenzimas

Enzimas Biloculadas. Ubicación parte en las

organelas y parte en el citoplasma

- GOT (glutámico-pirúvico
transaminasa) 60% en el
citoplasma y 40% en mitocondria,

- MDH (malato deshidrogenasa) 50%

en citoplasma y 50% en mitocondria.
 Tiempo de vida media en plasma

Vida media
Enzima promedio
Transaminasa glutámico-pirúvico 47±10 horas
(GPT o ALAT)
transaminasa glutámico- 17±5 horas
oxalacético
(GOT o ASAT)
Glutamato deshidrogenasa 18±1 horas
(GLDH)
lactato deshidrogenada (LDH) 113±60 horas

creatín quinasa (CK) 15 horas

aprox.
 Tiempo de vida media en plasma

Vida media
Enzima promedio
Fosfatasa alcalina 3-7 dias

γ-glutamiltranspeptidasa (γ-GT), 3-4 días

Colinesterasa (CHE) 10 días

aprox.
Amilasa 3-6 horas

Lipasa 3-6 horas

 Elevación de enzimas
celulares en plasma,
sugiere AUMENTO en
la velocidad de
destrucción celular y
tisular

Sin embargo, hay que tener en

cuenta que la realización de ejercicio
vigoroso libera en plasma, cantidades
significativas de enzimas musculares.
 Disminución de
enzimas
plasmoespecíficas en
sangre, sugiere
alteración en la
síntesis de la enzima,
disfunción tisular.
 ¿Por qué ocurre la salida irregular
de una enzima celular a la sangre?
Alteración en la permeabilidad de la
membrana celular

Enzimas de PM bajo son

las primeras que salen

Enzimas citoplasmáticas
aparecen primero que
enzimas mitocondriales
 ¿Hay enzimas exclusivas para un
órgano o tejido?

Escaso

El metabolismo en órganos/ tejidos es muy

similar

Alcohol deshidrogenasa hepática,

Fosfatasa ácida prostática útiles para
identificación específica de
enfermedades en estos órganos
Proporción de diferentes enzimas varían de
un órgano /tejido, a otro.

Combinado con el estudio cinético de

aparición y desaparición de determinadas
enzimas en el plasma, permiten un
diagnóstico de la implicancia de un órgano
específico.
¿Cómo se “visualiza” la acción catalítica
de una enzima ?

Concentración de sustrato que desaparece

por unidad de tiempo.

Concentración de producto que se forma

por unidad de tiempo.

La variación de un cofactor o de algún

componente de la reacción
 Desaparición de Sustrato
por unidad de tiempo

Incubación

enzimática
Actividad
Pepsina 37ºC
+ industrial + HCl
por tiempo
determinado
S
Albúmina
 Aparición de Producto
por unidad de tiempo
Fosfatasa
alcalina
p-Nitrofenilfosfato p-Nitrofenol + Fosfato
½ alcalino
(NaOH)

p-Nitrofenóxido
(color amarillo)
400 nm

Actividad
enzimática

pNitrofenóxido
 El NADH absorbe luz
de 340 nm, cosa que el
Variación de un NAD+ no hace.
cofactor
La absorbancia a 340
nm es proporcional a
la concentración
de NADH (Ley de
Absorbancia

Beer).

Cambios en la
absorbancia a 340
nm se corresponde a
cambios en la
concentración de
Long. onda (nm) NADH.
 Variación de un cofactor
GSH-Rd
GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+

Ab340 nm
NADPH NADP+
NADH NAD+
NADP+
NAD+

Lactato deshidrogenasa
L-lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H+

Ab340 nm
NADP+ NADPH
NAD+ NADH
NADPH
NADH
Medida de la Actividad Enzimática

1.Método de punto final

2.Método de punto múltiple
3.Método cinético
 1. Métodos de punto final
Son los más empleados.

Se inicia con la adición del sustrato o

enzima.

Se deja que ocurra la reacción durante un

tiempo dado.

Cumplido el tiempo de reacción, se

detiene y se mide la cantidad de producto
formado o sustrato desaparecido, a través
de curva calibración o Factor Calibración.
 1. Métodos de punto final

GOT
Aspartato + α-cetoglutarato oxaloacetato + glutamato

2,4 dinitrofenil Hidrazona

oxalacetato + hidrazina
½ alcalino
coloreada
(505 nm)

Temp. reacción = 20 ºC
Tiempo reacción = 20 min
2. Métodos de puntos múltiples

Miden el cambio de concentración a

diferentes intervalos de tiempo (cada
tiempo es un punto).

Es práctico para sistemas

automatizados.

Se emplea mayormente en sistemas de

reacción donde ocurre óxido-reducción
de NADH a NAD o viceversa.
 2. Métodos de puntos múltiples

Ventaja
Producto formado

Permite comprobar la
linealidad de la reacción
durante todo el tiempo
de la prueba

Tiempo
 3. Método cinético

Es la medida CONTINUA del cambio de

concentración en función del tiempo de
reacción.

Supone colocar la cubeta de reacción en el

espectrofotómetro, ajustar la long. onda
adecuada y leer en el registro, el cambio de
absorbancia como una línea.

Es práctico para propósito de investigación,

porque consume tiempo.
 3. Método cinético

LDH
Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+

La
velocidad de
desaparición del
sustrato
es proporcional a la
cantidad de
enzima LDH presente
en la muestra.
 Reacciones acopladas
GPT
Alanina + α-cetoglutarato piruvato + glutamato

GOT
Aspartato + α-cetoglutarato oxalacetato + glutamato

Ni sustratos ni productos absorben luz en el rango UV

o visible, por lo cual la determinación de las
transaminasas se realiza través de una reacción
acoplada que utiliza como sustrato un producto de la
reacción anterior.
 GPT
Alanina + α-cetoglutarato Piruvato + glutamato

LDH
Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+

La velocidad de la reacción catalizada por LDH estaría

determinada por la producción de piruvato proveniente
de la reacción catalizada por GPT.

Por lo tanto la velocidad de desaparición de NADH,

determinada midiendo absorción de luz 340 nm, será
proporcional a la actividad de GPT presente en la
muestra.
 GOT
Aspartato + α-cetoglutarato Oxalacetato + glutamato

MDH
Oxalacetato + NADH + H+ Malato + NAD+

En la determinación de GOT se acopla a la reacción

catalizada por la malato deshidrogenasa (MDH)
¿Cómo se expresa la velocidad
enzimática?

Unidad Internacional (U)

Cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 µmol de sustrato por
minuto.
 Sistema Internacional de
Unidades (SI)
katal (kat): Cantidad de enzima que
transforma 1 mol de sustrato por segundo.
1 katal = 60 x 106 U.
Esta unidad es muy grande, por lo que se
utilizan submúltiplos como
el microkatal (µkat, 10-6 kat), o
el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
La actividad de la lactato deshidrogenasa se
expresa en U/L.

Condiciones
Longitud de onda ...................................... 340 nm
Temperatura .............................................. 30°C o 37°C
Paso de luz ................................................ 1 cm
Tipo de reacción ........................................ cinética
Tiempo de reacción ................................... 3-5
minutos
Volumen de la muestra ............................. 25 μL
Volumen de reactivo ................................. 2.5 mL
Volumen total ............................................ 2.525 mL
Relación muestra/reactivo ......................... 1/100
Registrar el incremento en la absorbancia a 340 nm
durante intervalos de un minuto hasta que el cambio
en la absorbancia sea constante.

Calibración
No se requiere ningún estándar para calibrar el
procedimiento de LDH-L.

Los resultados se calculan utilizando la fórmula

proporcionada.
Cálculo
ΔA/min x volumen del análisis (mL) x 1000
LDH U/L = —————————————————————————
6.22 x paso de luz (cm) x vol. de la muestra (mL)

= ΔA/min x 16238

ΔA/min = cambio de absorbancia por minuto

Volumen del análisis = volumen total del análisis expresado en mL
1000 = convierte las U/mL a U/L
6.22 = coeficiente de absorbancia del NADH a 340 nm
Paso de luz = longitud del paso de luz expresada en cm (1 cm)
Volumen de la muestra = volumen de la muestra expresada en mL
16238 = factor derivado de las constantes de la ecuación
Ejemplo
0.005 x 2.525 x 1000
LDH U/L = ———————————
6.22 x 1 x 0.025

= 0.005 x 16238

= 81 U/L
Enzimas como reactivos analíticos

Ventajas

• Eficientes catalizadores

• Actúan bajo condiciones moderadas

Temperatura 20º a 40º C

• Simplificación de procesos
 Enzimas como reactivos analíticos

Condiciones generales para su utilización

Pureza
Estabilidad
Especificidad
Temperatura
pH
Fuerza iónica
Efectores

La actividad enzimática en el medio de reacción debe

estar en exceso para que sólo la concentración de
Sustrato que se quiere valorar, sea el paso limitante
 Enzimas como reactivos analíticos

Determinación de Glucosa en suero

Glucosa oxidasa
Glucosa + H2O + O2 Ácido glucónico + H2O2

4-amino Ácido p- Peroxidasa Quinona

+ +
2 H2O2 antipirina hidroxibenzoico roja + 4 H2O
 Enzimas como reactivos analíticos

Determinación de Triacilgliceroles en plasma

lipasa
Triacilgliceroles Acidos grasos + Glicerol
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP ADP + Glicerol-3-P
Glicerol-P oxidasa
Glicerol-3-P + O2 Dihidroxiacetona-P + H2O2

Peroxidasa Quinonimina
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + DCBS
roja
¡Fin de la
Clase!