MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE

MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE

Las poblaciones microbianas establecidas en
sistemas naturales pueden examinarse cualitativa
y cuantitativamente mediante varios métodos. En
muestras representativas se han analizado el
número total de individuos, el número de
poblaciones específicas o sus actividades
metabólicas y los resultados se han aplicado a
toda la comunidad o al ecosistema.
Una muestra representativa debe reflejar:

• Diversidad y la densidad microbiana

Se debe considerar que los microambientes son

heterogéneos y las muestras recolectadas pueden
no ser representativos del sitio, por ello se deben
recoger varias muestras y formar una muestra
compuesta.
La estrategia de muestreo
dependerá del objetivo del
análisis, los recursos
disponibles y las
características del sitio.

Los procedimientos de
muestreo deben asegurar
que la microflora no se
altere en número ni
actividades durante la
recolección y conservación
de la muestra.
Muestras de Suelos
MUESTRAS DE SUELOS
• Superficiales

• Subsuperficiales
• Debido a la abundancia de microorganismos en
el suelo que minimiza la influencia de
contaminantes del aire o de recipientes no
estériles, para recolectar muestras de suelo
superficial en forma rutinaria no se usa la
técnica aséptica.
Para la toma de muestras subsuperficiales se
tiene mas cuidado debido a 3 razones:

• Tienen poblaciones más bajas y un

contaminante externo puede afectar
significativamente el recuento,

• Los sedimentos subsuperficiales no están

expuestos ordinariamente a la atmósfera,

• Es más caro obtener muestras subsuperficiales y

generalmente no hay una segunda oportunidad
de recolección.
Las muestras subsuperficiales se congelan
inmediatamente y se envían al laboratorio o se
procesan “in situ”. En ambos caos la parte externa
se limpia usando una espátula estéril. La muestra
se pone en una bolsa plástica estéril y se analiza
inmediatamente o se congela
Tipos de muestreo
• Muestreo al azar:

Consiste en escoger al azar puntos de interés de los

que se recoge muestras a una profundidad definida.
• El muestreo transversal:

Incluye una colección de muestras en una sola

dirección.
• Muestreo en dos estadios

Un área se rompe en subunidades llamadas unidades

primarias y dentro de cada una de ellas se pueden tomar
submuestras al azar o sistemáticamente.

Se aplica cuando hay variabilidad entre las unidades

primarias, por ejemplo la pendiente de una colina y el
nivel plano
• Muestreo de rejillas

Con una rejilla de muestreo las muestras se toman

sistemáticamente a intervalos regulares y a espacios
fijos.

Este tipo de muestreo es útil para mapeo de un área de

la que se conoce poco acerca de la variabilidad en el
suelo.
El muestreo en dos dimensiones no
suministra información acerca de cambios
en la poblaciones microbianas de la
profundidad, cuando se requiere esta
información se debe realizar un muestreo en
tres dimensiones, para lo cual se toman
muestras a 50 cm. de profundidad
incrementando hasta llegar a los 200 cm o
puede implicar el drenaje de varios cientos de
metros en la subsuperficie de una zona.

Para muestreos de la subsuperficie se necesita

equipo especializado y es básico asegurar que
las muestras no se contaminen con muestra
superficial.
¿Cómo se realiza?
Para obtener una muestra de suelo a una profundidad
determinada, se usa un muestreador cilíndrico, este está
formado por un tubo hueco con un borde cortante y afilado.

El funcionamiento puede ser manual o mecánico, el

muestreador cilíndrico se puede usar a profundidades de 2
metros, la contaminación entre muestras se puede evitar
limpiando el muestreador luego de cada toma.
Toma de muestras subsuperficiales
• Para sistemas no saturados se
pueden usar dragas con
rotación de aire que permiten
obtener muestras hasta varios
cientos de metros de
profundidad. Se usa un
compresor para forzar aire o
un fluido hacia el tallo de la
draga para desplazar la broca
que corta el suelo.

• Los ambientes saturados se

muestrean de forma diferente
debido a que los sedimentos
son mucho menos cohesivos.
Hay que tomar en cuenta que
la rizósfera es una zona de
suelo (2-10 mm) que está
influenciada por las raíces
de plantas, allí la actividad
microbiana es alta y ocurren
interacciones plantas-
microorganismos.

Para tomar una muestra se

excava cuidadosamente y se
sacude con cuidado para
remover el suelo no
rizosférico, este método se
usa hasta hoy en día.
 Procesamiento de muestras y
almacenamiento en Suelos

• Los análisis microbiológicos deben realizarse lo

más pronto posible luego de la recolección para
minimizar los efectos de almacenamiento sobre
las poblaciones microbianas.

Una conservación a 4°C durante 3 meses reveló

reducciones en niveles y actividad microbiana.
• Previo análisis se debe tamizar el suelo a través
de mallas de 2 mm, se debe secar al aire el suelo
pero evitando que el contenido de la humedad
sea muy bajo, se puede guardar a 4°C antes de
examinar.

Se ha estudiado que el suelo conserva su humedad

hasta 21 días.
Muestras de agua
Para recolección de agua y
sedimentos se usan diferentes
aparatos manipulados
normalmente por control
remoto.

Algunos se han diseñado para

recolectar muestras a una
profundidad exacta, por
ejemplo 100 metros.
En el caso de muestras superficiales de agua, se lo
realiza de forma manual en recipientes
adecuadamente esterilizados, que garanticen
condiciones de asepsia.
Dispositivos de muestreo
• Botellas de Nansen y Van
Dorn.

Estas botellas no se pueden

esterilizar por tanto no son
adecuadas para muestreos
bacteriológicos, en cambio
permiten recolectar algas y
protozoos.
• Muestreador J-Z.

El dispositivo sirve para recoger

muestras de agua poco profundas,
consiste de una botella de vidrio a
la que se ha hecho el vacío, o un
bulbo de goma comprimido y un
tubo de vidrio con entrada sellada
cuando se alcanza la profundidad
deseada, se hunde un mensajero
pesado para que rompa el tubo de
vidrio del mecanismo de entrada,
de esta forma el agua entra en el
bulbo o recipiente.
• Bolsa mariposa de Niskin

La bolsa de Niskin es una bolsa

de polietileno en la que se ha
hecho el vacío, con un tubo de
goma de entrada sellado. La
bolsa se monta sobre un
soporte con muelles y cuando
llega a la profundidad deseada
se envía un mensajero que
libera una cuchilla que corta el
tubo de goma de la entrada,
hace que se dispare el muelle y
se abra la bolsa permitiendo la
entrada de la muestra.
Aguas profundas
Para recoger muestras a gran profundidad se
necesitan dispositivos que se abran a la
profundidad específica y luego de recolectada la
muestra se cierren nuevamente a fin de mantener
la presión hidrostática apropiada al subirlos a la
superficie.
Muestras de sedimento
Para tomar muestras de este
tipo se emplean muestreadores
tipo draga o cilíndricos, o
sondas de gravedad, estas
pueden presentar un
revestimiento estéril que
permite dividir la muestra es
secciones verticales.
En este tipo de muestreo se
debe impedir la compresión de
la muestra y mantener la
estratificación vertical de la
comunidad microbiana.
Muestras de aire
• Muestreo pasivo

Se usan placas Petri con un

medio de cultivo apropiado que
se exponen al ambiente durante
lapsos de 15, 30, 60 minutos y en
ubicaciones estratégicas de un
ambiente. Junto a las partículas
de aire sedimentan los
microorganismos.
• Filtración a través de
membrana.

En este caso se fuerza a pasar

un volumen determinado de
aire a través de un filtro de
membrana con tamaño de
poro apropiado para retener
al microorganismo de
interés.
• Muestreador de Andersen

El aire pasa a través de una serie

de rejillas graduadas con
tamaño de poro decreciente,
bajo cada rejilla hay una placa
de agar donde por inercia se
recogen los microorganismos.
A medida que disminuyen las
aberturas de la rejilla aumenta
la velocidad del aire de forma
que sucesivamente en cada
rejilla se depositan partículas
más pequeñas.
Muestras biológicas
• La recuperación de microorganismos
procedentes de organismos vivos tales como
plantas, animales, humanos usa métodos de
muestreo.

• Destructivos
• No destructivos.
Los métodos no destructivos se aplican a
superficies expuestas donde los microorganismos
no se encuentren adheridos fuertemente, las
muestras se obtienen mediante frotis con hisopos,
esponjas o lavados con soluciones estériles.
• Los métodos destructivos incluyen la disección o
trituración de tejidos para liberar organismos
que se encuentren adheridos firmemente y en el
interior de los tejidos.
• Adicionalmente se pueden obtener
microorganismos de fluidos vitales, como la
savia o sangre, productos de excreción como
orina y heces.
Procesamiento de las muestras
y almacenamiento
Cada determinación comprende tres fases:

• Recogida de muestras
• Procesamiento
• Mediciones.

Los análisis deben realizar rápidamente después

del muestreo para que reflejen fielmente la carga
microbiana real.
Muestras con muchos microorganismos por ejemplo
de suelos y sedimentos deben ser diluidas en forma
sucesiva hasta lograr concentraciones adecuadas, para
ello se mezclan con el diluyente apropiado.
En caso de realizar diluciones previo recuento de
viables, hay que tener presente que la eficacia en
la recuperación de microorganismos depende de
la composición química, la presión osmótica del
diluyente, el tiempo de mezcla, la temperatura, la
naturaleza química del agente dispersante, en caso
de que se use alguno, el grado de agitación.
En cambio, si tienen un número demasiado bajo
de microorganismo, como el agua de bebida o el
agua de mar, se deben concentrar por
centrifugación o filtración a través de membrana.
Cuando se recurre a la concentración, es necesario
seleccionar filtros adecuados, cuando los poros
son demasiado pequeños los filtros pueden
obturarse fácilmente, en contraste, los poros muy
grandes no retienen microorganismos.
Generalmente se emplean membranas de
nitrocelulosa con tamaño de poro de 0.45 um.
Detección de poblaciones
microbianas
En muestras ambientales
existen comunidades mixtas,
por tanto los métodos
establecidos para el recuento de
un grupo de microorganismos
pueden ser inadecuados para
otro, la diversidad de los
microorganismos y de sus
hábitat requiere el empleo de
métodos diferentes, los
métodos para el recuento de
virus, bacterias, hongos y
protozoos son diferentes.
Para llevar a cabo el recuento de microorganismos
se emplea:

▫ Métodos Clásicos
▫ Métodos Moleculares
Dentro de los métodos clásicos encontramos:

• La observación directa o recuento directo

• Procedimientos indirectos o recuento de viables.

Ocasionalmente el número de microorganismos se

calcula a partir de métodos que determinan los
constituyentes bioquímicos específicos de estos, con lo
que en realidad se mide cantidad de biomasa.
Técnicas de recuento directo
Un recuento directo es un recuento de las células
individuales de una población microbiana. El
recuento directo puede hacerse visualmente,
utilizando un microscopio y un porta especial
denominado cámara de recuento.
Recuento microscópico.
• El recuento microscópico es de interés para
determinar números de microorganismos
asociados con un ambiente o proceso.

• El recuento microscópico es necesario si la

muestra contiene partículas extrañas, como
células sanguíneas o fragmentos de suelo.

• Los recuentos directos incluyen organismos

viables, muertos y viables pero no
cultivables por lo que generalmente dan
números más altos que los métodos de
cultivo
Cámaras de recuento
• Para la enumeración de protozoos, algas y hongos se emplean
cámaras de recuento como la cámara de Petroff-Hauser.

• Todas las cámaras de recuento poseen una profundidad

conocida y tienen marcados unos cuadrados de dimensiones
también conocidas. De esta manera, cada cuadrado que
observamos al microscopio representa un volumen
determinado de líquido.

• Puesto que las células vivas y las muertas tienen un aspecto

parecido observadas al microscopio, el recuento directo es un
recuento total de células.
El recuento directo también puede
hacerse electrónicamente, con un
instrumento denominado contador
Coulter.

Se coloca en una cámara del contador

un volumen determinado del cultivo y
se hace pasar a través de un pequeño
poro (de unos 15 µm de diámetro) a otra
cámara, mediante una bomba de vacío.
El poro forma parte de un circuito
eléctrico, de manera que cada vez que
pasa una célula a través del mismo, la
conductividad del circuito disminuye y
la presencia de la célula es detectada
electrónicamente en el contador.
Recuento de viables
Hay dos técnicas básicas para el recuento de
viables:

• Técnica de recuento en placa.

• Técnica del número más probable (NMP).
Recuento en placa

• Para realizar un recuento en placa se

utilizan los métodos de extensión o de
vertido en placa, empleados para cultivar los
microorganismos.

• Después de la dilución o concentración, la

muestra se adiciona a las cajas Petri
conteniendo un medio de crecimiento.

• La siembra se puede hacer de dos maneras

diferentes. Técnica de placa de extensión o
la Técnica de vertido en placa (0.1 a 1 mL de
diluciones de la muestra).
• Luego de la siembra, las muestras se incuban bajo condiciones
especificadas, de acuerdo al tipo microbiano, se obtienen colonias
aisladas.

• Para hacer un recuento en placa se tomará en cuenta: la

composición de medio de cultivo, las condiciones y el período de
incubación.

• Las condiciones pueden ajustarse de manera que sólo se haga el

recuento de los miembros de un grupo definido, los medios de
cultivo pueden ser selectivos o diferenciales.

• La composición del medio y/o las condiciones de incubación

impiden el crecimiento de otros grupos.

• Los medios pueden diseñarse para el recuento selectivo de hongos,

cualquiera que sea este se adicionarán inhibidores bacterianos como
el rosa de bengala, estreptomicina o neomicina, gentamicina,
cloranfenicol, las bacterias también se pueden controlar mediante
pH:entre 4.5 y 5.5 .

• Para seleccionar bacterias Gram negativas se usarán penicilina o

azul de metileno que inhiben a Gram positivos.
• El recuento en placa es un recuento de viables,
Se basa en el principio de que una única célula
viable originará una colonia visible, cuando se
siembre en una placa de agar.
• La ventaja del método de recuento en placa es su
gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas
condiciones de incubación adecuadas, puede
detectarse incluso una única célula viva.

• El recuento en placa no requiere un equipo

complicado. Un inconveniente es que el recuento
en placa es lento y tedioso y no es muy preciso,
porque la precisión depende del recuento de un
número elevado de colonias. La precisión
aumenta con el número de colonias que se
recuentan, ya que disminuye el error debido
al muestreo.
Número mas probable
• El NMP requiere la realización una serie de
diluciones seriadas al décimo de la muestra de
cultivo, en un medio líquido adecuado para el
crecimiento de dicho organismo.

• Después de la incubación los tubos se califican

como positivos o negativos para el crecimiento
en base de factores como turbidez, producción
de gas y apariencia del substrato.
• La calificación de un tubo positivo para
crecimiento significa que por o menos un
organismo cultivable estuvo presente en la
dilución usada para su inoculación.

• El número de tubos positivos y negativos por

cada dilución se usa para calcular el número
presente en la muestra original mediante el uso
de tablas estadísticas del NMP o programas
computarizados diseñados para simplificar los
análisis.
• El método del NMP se utiliza para contar
microorganismos que son difíciles de cultivar en
medio sólido. También se usa para determinar el
número de células de un cultivo mixto que
pueden crecer en un medio líquido determinado.