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LABORATORIO DE

REFERENCIA REGIONAL
DE AREQUIPA
BLGA. MARIA KATHERINE GONZALES BUSTAMANTE
ANALISTA EN EL AREA DE VIH
SIFILIS

 Es una infección sistémica de evolución crónica, con


períodos asintomáticos.
 Agente: Treponema pallidum pallidum
 Vía de transmisión: Sexual y Vertical
Treponema pallidum
pallidum
 Forma : Espiral
 Diámetro : 0.25 µm
 Largo : 8-15 µm
 Coloración : Argéntica
 Observación : En Campo Oscuro
 Cultivo : No cultivable
ESTADIOS DE LA SIFILIS

 PRIMARIA: Ubicación del Treponema en


órganos genitales (Chancro duro)

 SECUNDARIA: Diseminación en el
organismo (lesiones dérmicas)
- Sífilis latente temprana
- Sífilis latente tardía
 TERCIARIA: Organos vitales afectados
(Sistema cardiovascular y/o neurológico)
Genero Treponema: No cultivables
(patógenos)
 Treponema pallidum pallidum
 Treponema pallidum pertenue
 Treponema pallidum endemicum
 Treponema carateum
 Treponema paralisscuniculli
Genero Treponema: Cultivables
(No patógenos)
 Treponema denticola
 Treponema phagedenis
 Treponema vicentii
 Treponema refringens
 Treponema hyodysenteriae
 Treponema scoliodontum
 Treponema bryantii
PRUEBAS DE LABORATORIO

 INDIRECTAS: - No treponémicas
- Treponémicas
PRUEBAS SEROLOGICAS NO
TREPONEMICAS

 VDRL: Venereal Disease Research Laboratory

 USR: Unheated serum Reagin

 RPR: Rapid Plasma Reagin


PRUEBAS SEROLOGICAS
TREPONEMICAS NO
CONFIRMATORIAS
 ELISA: Antígenos recombinantes

 Inmunocromatografía:
Antígenos recombinantes
PRUEBAS SEROLOGICAS
TREPONEMICAS
CONFIRMATORIAS
 FTA-ABS:
Fluorescent Treponema
Antibody Absortion

 MHA-TP:
Microhemaglutinación para
Treponema pallidum

 WESTERN BLOT / LIA


Pruebas No Treponémicas
VDRL

 COMPONENTES:
( Antígeno no Treponémico)
 Lecitina
 Cardiolipina
 Colesterol
 Buffer
USR

 COMPONENTES
( Antígeno no Treponémico)
 Cardiolipina
 Lecitina
 Colesterol
 EDTA
 Acetil colina
USR: METODOLOGIA

 Colocar 50 ul en cada círculo de la lamina


 Extender la muestra de suero
 Agregar 22 ul de antígeno
 Rotar a 180 rpm por 4 minutos
 Observar la reacción en microscopio 100X
REPORTE DE RESULTADOS

 Reactivo: Grumos medianos a grandes

 Reactivo Débil: Grumos pequeños con


partículas de antígeno libre.

 No Reactivo: Sin grumos (antígeno libre)


PRUEBA NO TREPONEMICA
MACROSCOPICA: RPR

Prueba de floculación macroscópica en


tarjeta, en la cual una suspención
antigénica conteniendo antígeno VDRL
modificado más carbón es mezclado
con suero humano.
Si en el suero están presentes anticuerpos,
se produce la reacción Ag-Ac dando
lugar a la formación de grumos de
floculación los cuales pueden ser
visualizados sin ayuda de microscopio.
RPR

 COMPONENTES
( Antígeno no Treponémico)
 Cardiolipina
 Lecitina
 Colesterol
 EDTA
 Acetil colina
 Carbón
RPR: METODOLOGIA

 Colocar 50 ul en cada círculo de la tarjeta


 Extender la muestra de suero
 Agregar 17 ul de antígeno
 Rotar a 100 rpm por 8 minutos
 Observar la reacción visualmente
REPORTE DE RESULTADOS

 Reactivo: Grumos negros medianos a


grandes.

 Reactivo Mínimo: Grumos pequeños


pero definidos.

 No Reactivo: Sin grumos.


Ejemplo:

SUERO DILUCIONES DEL TITULO


SIN SUERO
DILUIR
1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 .

R R R Rm NR Reactivo: 8 dils.

R Rm NR NR NR Reactivo: 2 dils.

Rm NR NR NR NR Reactivo: 1 dil
RPR
Rapid Plasma Reagin

REACTIVO MÍNIMO
GRUMOS PEQUEÑOS NO BIEN
DEFINIDOS
1 DIL cuando sólo se presenta
en el suero sin diluir
2 DIL cuando es visible hasta la
dilución 1:2
INTERPRETACION DE RESULTADOS
PRUEBAS NO TREPONEMAICAS - I
 Un resultado reactivo puede indicar
 Infección presente o pasada con Treponemas patógenos.
 Puede ser una reacción falso positiva, lo cual se detecta
mediante una prueba confirmatoria

 Un resultado no reactivo sin evidencia


clínica:
 Puede indicar que no hay infección por treponemas o que el
tratamiento fue efectivo.
INTERPRETACION DE RESULTADOS
PRUEBAS NO TREPONEMICAS - II

 Un resultado no reactivo con


evidencia clínica:
 Puede observarse en sífilis primaria o en sífilis
secundaria por exceso de anticuerpos (prozona)

 El incremento en cuatro veces el


título inicial indica Infección o re-
infección y la disminución de
cuatro veces el título indica un
tratamiento efectivo.
Inmunocromatografía
Interpretación de los
Resultados

POSITIVO NEGATIVO
Dos Líneas: línea C Solo la Línea C
línea T

INVALIDO
No aparece la línea “C” y puede aparecer la línea “T”
Repetir la prueba
INMUNOCROMATOGRAFIA
EVOLUCION NATURAL DE LOS
ENSAYOS NO TREPONEMICOS
Contagio Chancro Duro

Sífilis
Primaria Sífilis
Período
Sífilis Terciaria
Incubación
Secundaria

Sífilis
Latente
Títulos de la Serología
ZONAS DE INTERACCION AG-AC
PRUEBAS SEROLOGICAS
TREPONEMICAS
CONFIRMATORIAS
 FTA-ABS:
Fluorescent Treponema
Antibody Absortion

 MHA-TP:
Microhemaglutinación para
Treponema pallidum

 WESTERN BLOT / LIA


FTA-ABS

 1957: Deacon Anticuerpos fluorescentes Ig G anti


Treponema pallidum
 Falcone y Harris, dificultades en sensibilidad y especificidad
 Suero dilución 1:5, falsos positivos
 1964: Hunter, Deacon y Meyer (FTA-ABS)
FTA-ABS: Metodología

 Diluir el suero 1:5 en PBS  Dejar secar utilzando el


y en Sorbente (25 µl de secador del kit
suero en 100 µl
diluyente)  Depositar 1 gota (20 µl
) del conjugado a
 Colocar en c/pocillo cada pocillo
de la lámina p.o 1 gota
(aprox 20 µl) del suero  Incubar a 37°C en
diluido 1:5 cámara húmedad
durante 30 min
 Incubar a 37°C en
cámara húmeda  Hacer los lavados del
durante 30 min paso anterior
 Lavar con PBS a chorro  Secar
min  Hacer montaje
 Lavar con PBS x 10 min  Observación en
y luego nuevamente x microscop
5 min
FTA-ABS : Reactivo
Interpretación y reporte de
resultados
Lectura de la Lectura de la
Prueba inicial prueba repetida Reporte
4+ Reactivo
3+ Reactivo
2+ Reactivo
1+a >1+ Reactivo
1+ 1+ Reactivo mínimob
1+ <1+ No reactivo
<1+ No reactivo
N No reactivo
Fluorescencia en Fluorescencia
forma de rosario atípica observadac

a Repetir las muestras


b En ausencia de historia o evidencia clínica de infección trep
c Observado en pacientes con LE, autoinmunes
PRUEBA TREPONEMICA:
MHA-TP
Hemaglutinación pasiva en la cual suero humano
diluido es enfrentado a glóbulos rojos de carnero
o pollo sensibilizados con Treponema pallidum.
Cuando en la muestra de suero existe anticuerpos
contra Treponema se forma una malla de
aglutinación.
TPHA: Metodología (Biomerieux)

 Establecer protocolo de  Adicionar 75 µl de células


trabajo control al 2do pocillo
 Colocar 100 µl del diluyente  Adicionar 75 µl de células
en c/u pocillos 1era fila de prueba al 3er pocillo
 Colocar 25 µl de diluyente  Agitar suavemente
a los pocillos de la 2da
hasta 4ta fila  Dejar en reposo durante 45
a 60 minutos antes de leer
 Colocar 25 µl de suero a los resultados
pocillos de la 1era fila
 Las placas pueden
 Mezclar cuatro veces y igualmente ser leídas
transfiera 25 µ l a la 2da fila, después de una noche de
mezcle y transfiera 25 µl a incubación.
la 3era fila, mezcle y
elimine 25 µl de esta última  Leer e interpretar los
fila. resultados
 Mezclar cuatro veces y
transfiera 25 µ l a la 2da fila,
mezcle y transfiera 25 µl a
la 3era fila, mezcle y
elimine 25 µl de esta última
fila.
GRADOS DE
AGLUTINACION
 Ausencia de anticuerpos
formación de botón

 Presencia de anticuerpos
formación de malla.
Inmunoensayo en Linea
COMPARACION DE PRUEBAS DE REACTIVIDAD POR CATEGORIA DE
ENFERMEDADES PROBADAS CON 75 SUEROS DE INDIVIDUOS
SIFILITICOS Y 122 SUEROS DE INDIVIDUOS NO SIFILITICOS
N° CON REACTIVIDAD PARA :
CATEGORIA FTA - ABS ELISA MHA -TP VDRL TOTAL
SIFILIS PRIMARIA
No tratada 22 17 9 17 22
Tratada 2 1 2 1 2
SIFILIS SECUNDARIA
No tratada 8 8 6 8 8
Tratada 12 12 12 12 12
SIFILIS LATENTE
No tratada 13 12 12 10 13
Tratada 10 10 9 9 10
Tx. No conocido 1 1 1 1 1
Latente cuestionable 3 3 3 0 3
NEUROSIFILIS 3 2 2 0 3
SIFILIS CARDIOVASCULAR 1 1 1 0 1
NO SIFILITICO
Aparentemente normal 1 1 0 178
Falso positivo Biológico 1 0 0 7 15
Otras Enfermedades 1 1 0 1 29
Fuente: Jour Clin Microb, Apr 1982 p.630-634
Pruebas serológicas para el
diagnóstico de Sífilis
Sensibilidad y especificidad de las
pruebas serológicas en los
diferentes estadios de la sífilis

Prueba Primaria Secundaria Latente Tardía Especificidad


VDRL 78% 100% 95% 71% 98%
RPR 86% 100% 98% 73% 98%
USR 84% 100% 97% 99%
TRUST 85% 100% 95% 93%
FTA-ABS-DS 80% 100% 100% 96% 98%
TPHA 76% 100% 97% 94% 99%
Captia IgM* 90% ? ? ? 90%

Fuente: Servicio de Microbiología Hosp. Doce de Octubre.Madrid. Antonio Fuentes.


REACCIONES FALSAS POSITIVAS EN LAS PRUEBAS
RPR, FTA-ABS Y HA EN 100 PACIENTES CON INFECCION
N° de casos encontrados
Agente Infeccioso N ° de RPR FTA FTA HA
Casos Reactivo Reactivo Dudoso Reactivo

Adenovirus 6 0 0 1 0
Coxackie virus 20 0 4 1 1
Cytomegalovirus 8 0 0 2 1
Herpes Simplex II 7 1 0 3 0
Influenza virus 10 0 1 1 0
Parótidas virus 1 0 0 1 0
Parainfluenza virus 2 0 1 0 0
Sincitial Respiratorio Virus 1 0 0 0 0
Rubella virus 1 0 0 1 0
Rubeola virus 17 0 0 1 0
Varicella zoster virus 1 0 0 1 0
Mycoplasma pneumoniae 20 0 0 1 0
Chlamydia psittaci 1 0 0 0 0
Blastomyces dermatidis 1 0 0 0 0
Coccidioides immitis 4 0 0 0 0
TODOS LOS GRUPOS 100 1 6 12 2
Fuente: Jour Clin Microb 1979 Vol 9 N° 3, p. 369-372.
REACCIONES INESPECIFICAS DE
LOS ENSAYOS NO TREPONEMICOS
CAUSAS BIOLOGICAS
SON CONDICIONES DEPENDIENTES
DEL PACIENTE:
* Enfermedades Infecciosas
* Enfermedades No Infecciosas
* Causas No Patológicas
REACCIONES INESPECIFICAS DE
LOS ENSAYOS NO TREPONEMICOS

ENFERMEDADES INFECCIOSAS
BACTERIANAS
Lepra lepromatosa, TBC miliar,
Neumonía neumocócica,
Endocarditis bacteriana,
Escarlatina, Pian, Pinta,
Leptospirosis
REACCIONES INESPECIFICAS
DE LOS ENSAYOS NO
TREPONEMICOS

POR PROTOZOARIOS
Paludismo y Tripanosomiasis
POR RICKETTSIAS
Tifus exantemático
VIRALES
Sarampión, Varicela, Hepatitis,
Mononucleosis infecciosa
REACCIONES INESPECIFICAS DE
LOS ENSAYOS NO TREPONEMICOS

ENFERMEDADES NO INFECCIOSAS
 Enfermedades del Colágeno (en particular
Lupus Eritematoso Sistémico)
 Mielopatías
(especialmente Mieloma Multiple)
* Otras: Gammapatías, Drogadicción,
Dislipidemias intensas
(por turbidez del suero)
REACCIONES INESPECIFICAS DE
LOS ENSAYOS NO TREPONEMICOS

CAUSAS NO
PATOLÓGICAS
EMBARAZO
SENILIDAD
REACCIONES INESPECIFICAS
DE LOS ENSAYOS NO
TREPONEMICOS

CAUSAS NO BIOLÓGICAS
DEPENDEN DE LAS CONDICIONES DEL ENSAYO
* TECNICA INADECUADA
* INTERPRETACIÓN INCORRECTA
* REACTIVO DE MALA CALIDAD, CONSERVADO
INADECUADAMENTE Ó VENCIDO
Evaluación de reactividad
de kits de diagnóstico para
sifilis
Tipo de Nombre del Kit Tipo de antígeno Presentación Lote Fecha de Sensibilidad % Especificidad
ensayo Evaluado evaluación %
ELISA SYPH AB DIA.PRO Antígenos sintéticos purificados de 192 0708 17/12/2008 100.00 97.78
DIAGNOSTIC BIOPROBES Trponema pallidum Determinaciones
ELISA BIOELISA SYPHILIS 3.0 - BIOKIT Antígenos recombinantes p47, p17 y p47 de 96 G-5308 16/12/2008 100.00 100.00
Treponema pallidum determinaciones
RPR RPR NOSTICON II - BIOMERIEUX Suspensión de antígeno VDRL 500 8028066362 13/01/2009 100.00 100.00
modificado absorbido sobre partículas de Determinaciones
carbón
ELISA ENSAYO INMUNOENZIMATICO Antigenos recombinantes 15Kd, 17 Kd, 47 96 828703 15/01/2009 100.00 92.60
(ELISA) PARA LA DETECCION DE Kd Antígenos de Treponema pallidum Determinaciones
ANTICUERPOS IgG, IgM e IgA ANTI
Treponema pallidum EN SUERO O
PLASMA – NEW MARKET
LABORATORIES
INMUNOCR DETERMINE SYPHILIS TP – Inmunocromatografía para la detección 100 72633U101 19/02/2009 100.00 100.00
OMATOGR INVERNESS MEDICAL JAPAN Co.,Ltd cualitativa de anticuerpos frente a Determinaciones
AFIA Treponema pallidum.
RPR RPR - CARBON- LINEAR Suspensión de antígeno LIPíDICO sobre 500 25138 08/042009 100.00 100.00
CHEMICALS. S.L. partículas de carbón Determinaciones
ELISA ENSAYO INMUNOENZIMATICO Antigenos recombinantes 96 C-2109 05-08-2009 100.00 100.00
(ELISA) PARA LA DETECCION DE de Treponema pallidum Determinaciones
ANTICUERPOS CONTRA EL INMOVILIZADOS
Treponema pallidum BIOKIT.
HEMAGLU TPHA-TEST PARA LA DETECCION Antígeno treponémico adherido a eritrocitos 200 J535810 05/08/2009 100.00 100.00
TINACION DE ANTICUERPOS ANTI Treponema de ave suspendido en un diluyente. Determinaciones
pallidum EN SUERO- OXOID
Conclusiones

 Los resultados obtenidos muestran que el Kit evaluado -BIOKITIN -


presentó sensibilidad de 100 % y especificidad de 98%

 Nota: Los resultados del control de reactividad del kit BIOKITIN


son válidos para la muestra del lote E20102
FLUXOGRAMA PARA CONFIRMACION DE SIFILIS POR SEROLOGIA

Prueba de tamizaje

No Reactivo Reactivo

Cuantificación Confirmación:
TPHA o FTA-ABS

Informe del
resultado
Informe del
resultado