TPN°1: EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE

ÁCIDOS NUCLEICOS.

Bqca. Marcela Alejandra Guastavino – Lic. María Mercedes Tiscornia.

CÁTEDRA DE BIOLOGÍA MOLECULARY GENÉTICA. FCEQyN. UNaM.
Dogma
central de
la biología
molecular
Estructura del
ADN

El ADN se encuentra en el núcleo (en eucariotas) o en el citoplasma (en procariotas) y es la

molécula que contiene toda la información genética necesaria para construir un organismo y
para que éste funcione como lo hace.
Material de partida
Bacterias, vegetales, animales y humanos
Pasos para la extracción de Ácidos
Nucleicos.
Eliminación de
Eritrocitos. Ruptura
de la Pared y
Membrana Celular

Purificación

Precipitación

Lavado,
Rehidratación y
Almacenamiento
Equipos para Lisis celular
 LISIS DE GLÓBULOS ROJOS
 Sacarosa: aporte osmótico ejercido por la sacarosa permitirá la
ruptura de las membranas del glóbulo rojo.
 Tritón X100detergente para desorganizar las membranas
biológicas, permitiendo la ruptura de las mismas.
 Tris: éste es un compuesto básico (2-amino-2-(hidroximetil)-1, 3-
propanodiol) para la preparación de diversos tampones, y como
agregado en reactivos de lisis, purificación, y resuspensión de
ácidos nucleicos.

Realizamos
sucesivos
lavados y
recuperamos
el pellet con
los glóbulos
blancos.
 Ruptura de la pared celular
 El tiempo consumido en la destrucción de la pared
celular es suficiente para que la activación de enzimas
provoque la pérdida del material genético.
 Es importante tener congelados los morteros, los
brazos de morteros, los microtubos donde
depositaremos la muestra pulverizada y todo elemento
que se pondrá en contacto con la muestra hasta que se
le adicione la solución de extracción en caliente.
 En hongos y bacterias la lisis de la pared celular se
puede realizar también mecánicamente.

Debemos tener la precaución de

trabajar a las más bajas
temperaturas posibles y con la
mayor velocidad.
 Componentes para lisar la célula
 Tris: éste es un compuesto básico (2-amino-2-(hidroximetil)-1, 3-
propanodiol) para la preparación de diversos tampones.
 EDTA: es el ácido etilendiaminotetraacético, y generalmente se
provee en forma de sal disódica. Está incluido en muchos buffer de
extracción para quelar cationes divalentes tales como Mg 2+ o
Ca2+, los cuales son cofactores de enzimas que degradan el ADN.
Sin embargo, existe una ADNasa que es estimulada por EDTA.
 Cloruro de Sodio: las sales se agregan a los fines de estabilizar el
medio salino y además para coadyuvar a la lisis de las paredes
celulares vegetales o a las membranas biológicas en caso de las
muestras de mamíferos. Las sales aumentan el poder iónico de la
solución y ocasionan la precipitación de ADN. Se ha observado
que concentraciones más elevadas de este compuesto pueden
ayudar a la eliminación de polisacáridos.
 Otros compuestos que lleva la lisis según
el material de partida
 Dentro del buffer utilizado variamos los detergentes, CTAB y SDS,
que ya han sido utilizados en métodos de extracción existentes. El
detergente actuará formando micelas con los componentes lipídicos
de las membranas biológicas.
 El agente reductor, β-mercaptoetanol, es incluido en buffer de
extracción para proteger el ADN contra quinonas, bisulfitos,
peroxidasas y polifenoloxidasas. Podría ayudar a eliminar los
polisacáridos que son contaminantes, que usualmente se piensa que
coprecipitan con el ADN.
 Proteinasa K, es una enzima que cliva específicamente las uniones
peptídicas que involucran a aminoácidos alifáticos, aromáticos o
hidrofóbicos. La temperatura óptima que se encuentra entre 55-
65ºC. La actividad de ésta enzima puede ser aumentada por la
adición al medio del detergente SDS (dodecil sulfato de sodio).
 CTAB-NaCl
 Diferencias en la solubilidad de ácidos nucleicos y polisacaridos en
presencia de CTAB ayuda a la eliminación de la contaminación con
polisacáridos.
 Adicionalmente el CTAB puede ser usado para precipitar el ADN
cuando la concentración de NaCl es <0,7M.
Concluimos para Lisis

 La presencia de detergentes, agentes quelantes de metales

divalentes, y proteasas estables tales como la proteinasa K
durante el proceso de aislamiento, previene cualquier hidrólisis
del DNA por nucleasas celulares y asegura el aislamiento de DNA
intacto.
 Purificación: Remoción de las
proteínas

PROTEINASAS: SOLVENTES ORGÁNICOS SALES

esto se agrega en
la lisis celular

PROTEINASA K •CLOROFORMO:ALCOHOL ALTA

ISOAMÍLICO CONCENTRACIÓN

•FENOL
FASE ACUOSA
INCUBAR
DE 55 A 65°c FASE ORGÁNIA SALTING OUT
Otros agentes de purificación

 Las concentraciones elevadas de agentes caotrópicos

como las sales de guanidinio y la urea permiten
que las moléculas de agua penetren en las proteínas,
desorganizando así las interacciones hidrofóbicas que
estabilizan por lo común la conformación nativa.
Kit de purificación

 Tiosianato de guanidina, tiene 2 propiedades útiles para

la purificación de ADN.
 Primero, desnaturaliza y disuelve todos los otros compuestos
menos los ácidos nucleicos por lo que virtualmente puede ser
usado para rescatar el ADN de cualquier tejido.
 Segundo, en la presencia de tiocianato de guanidina el ADN
se une a la sílica por lo que esta propiedad se aprovecha para
aislar el ADN por cromatografía por columna y el ADN es
recuperado adicionando agua ya que esta desestabiliza las
interacciones entre esta molécula y la sílica.
 Precipitación
 Los alcoholes disminuyen la solubilidad del DNA. Tras la
precipitación y centrifugación, podemos obtener un pellet,
que representa el DNA concentrado y en condiciones de
pureza.

Lavado, Rehidratación y
Almacenamiento
 Lavado con etanol al 70%
 Rehidratación con Agua destilada libre de nucleasas
 Almacenamiento a -20°C
Extracción de RNA para RT-PCR
 El RNA es una molécula monocatenaria que no presenta
conformación estructural de órden superior. Eventualmente
algunos RNAs alcanzan algún tipo de estructura secundaria
en regiones de la molécula, gracias al plegamiento de su
única hebra sobre sí misma.
 En líneas generales deberemos romper la membrana
plasmática, pared celular vegetal o bien pared celular
bacteriana, haciendo uso de las mismas metodologías
expuestas anteriormente. Sin embargo tendremos que
tener en cuenta la labilidad de la molécula de RNA.
 Extracción de RNA: Trizol
 El reactivo Trizol (Invitrogen) es un agente listo para usar,
que consiste en una solución monofásica de isotiocianato de
guanidinio y fenol.

Sarkosyl
Detergentes
Triton X
Extracción de RNA
 EVITAR DEGRADACIÓN DE RNA

Dietilpirocarbonato Inactiva las ribonucleoproteinas

(DEPC) por unión covalente

•Trabajar en un ambiente libre de Rnasas.

•Usar guantes a lo largo de todo el proceso.
•Trabajar rápido para evitar la degradación del RNA durante la manipulación.
EXTRACCIÓN DNA Vs. RNA
ETAPA DNA RNA
LISIS CELULAR CTAB, SDS, Tris-HCl, SARKOSYL, TRITÓN X,
EDTA, β- ISOCIANATO DE
MERCAPTOETANOL GUANIDINA, FENOL
PURIFICACIÓN PROTEINASA CLOROFORMO
STES. ORGÁNICOS
SALES
PRECIPITACIÓN ALCOHOLES ALCOHOLES
ALCOHOLES + SAL
LAVADO ETANOL 70% ETANOL 70%

REHIDRATACIÓN TE Ó H2O H2O TRATADA CON

DEPC

ALMACENAMIENTO -20° C -70° C

Microtubo con ovillo de DNA
Pasos para la extracción de Ácidos
Nucleicos.
Eliminación de
Eritrocitos. Ruptura
de la Pared y
Membrana Celular

Purificación

Precipitación

Lavado,
Rehidratación y
Almacenamiento
Muchas gracias por su atención!!