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LABORATORIO

PARASITOLÓGICO
ENTEROPARASITOS – PARÁSITOS HÍSTICOS
Dra. Pamela Bautista Sosa
Médico Patólogo clínico - HNDM

LABORATORIO CLÍNICO
13/05/2019
Helmintos Protozoarios

Larvas Trofozoitos
Huevos Quistes
Gusanos Ooquistes
Parasitosis
Colección de la muestra
• Obtención de muestra fecal:
• Muestras emitidas espontáneamente
• Envase de plástico seco y limpio
• No mezclarse con orina
• Enviar al laboratorio inmediatamente
Colección de la muestra

• Sustancias interferentes:
• Bario
• Bismuto
• Aceite mineral
• Metronidazol
• Tetraciclinas.
Colección de la muestra
• No dejar las muestras de heces expuestas al aire en
recipiente sin tapa.
• No exámenes radiológicos con medio de contraste.
• No Purgantes, Antiácidos, Preparados de bario y bismuto,
Antidiarreicos por lo menos 1 semana.
• No ablandadores de heces.
• No aceptar muestras de heces mezcladas con orina.
Colección de la muestra

• Número de muestras:
• Probabilidad de detectar parásitos en una única muestra 50 a
60% , si se analizan 3 muestras >95%.
• Colectar muestras en días diferentes

• Refrigeración:
• Máximo 24 horas a 4°C
Colección de la muestra
• Preservantes de materia fecal:
Si no se puede respetar los tiempos:
• SAF (acetato de sodio-ácido acético- formaldheído)
• Solución salina o acuosa formolada (5 o 10 %)
• PVA (alcohol polivinílico)- Schaudinn
• Solución de dicromato de potasio (2,5%)
• Merthiolate-yodo-formaldehído (MIF)
DIAGNÓSTICO
Procedimientos para la detección de
parásitos

• Métodos directos: observación y


reconocimiento de características morfológicas
macroscópicas y microscópicas.

• Métodos indirectos

• Pruebas moleculares
Métodos directos

Es la observación del agente etológico y sus


características morfológicas
• Examen macroscópico
• Examen microscópico
• Métodos de concentración
• Métodos cualitativos y cuantitativos ( kato-Katz )
• Coloraciones
Métodos indirectos

• La detección indirecta del parasito se fundamenta en


la respuesta inmunológica humoral del paciente.

• También se considera la captura de los antígenos


que el parasito libera.

• Los más empleados son aglutinación, fijación de


complemento, ELISA, IFI, difusión en gel, Western
Blot
Pruebas moleculares

• La posibilidad de determinar el genoma de un


parasito mediante métodos de hibridación del ADN
nos permite realizar diagnósticos precisos.

• Son empleados en Laboratorios de Referencia para


parásitos de interés prioritario o casos de difícil
diagnostico.

• Se analizan dos tipos de moléculas : ADN y ARNm

• Métodos : PCR, Southern Blot


Métodos directos

• Principios generales:
• Comenzar a examinar las muestras más líquidas.
• Examinar heces frescas de menos de 1 hora de eliminadas,
aumenta la posibilidad de encontrar amebas.
• Los trofozoitos se inmovilizan en solución de yodo y puede
ser difícil diferenciar entre trofozoitos y quistes.
• En las heces líquidas los depósito de moco frecuentemente
contienen grupos numerosos de Giardia Lamblia.
• Elegir una porción de la superficie de la muestra donde se
encuentre el moco.
DIAGNOSTICO

Examen directo
1.Macroscópico
• Consistencia: moldeada, pastosa, semilíquida, líquida
• Color: marrón, amarillo, negruzco, verdoso
• Olor: “sui generis”, fétido, butírico
• Presencia de elementos anormales: sangre, mucus, pus
• Presencia de seudoparásitos
• Búsqueda de parásitos macroscópicos

Muestras diarreicas y
muestras con sangre
deben procesarse
inmediatamente.
DIAGNOSTICO

Examen directo
2.Microscópico
• Examen directo de una pequeña porción de heces
frescas.
• Examen después de aplicar un método de
concentración.
• Examen de frotis o preparaciones permanentes.
Examen directo SSF LUGOL

2.Microscópico
Estructuras sin color Detalles finos de los
VENTAJAS Formas móviles Parásitos: núcleo,
de los parásitos Vacuolas, flagelos.
•Método diagnóstico por excelencia
•Fácil, económico, rápido
•Pobre si es una sola muestra
•Mejora si es seriado: tres muestras
•Pequeña cantidad de heces.
•Movilidad de trofozoítos, células
intestinales, células inflamatorias

DESVENTAJAS
•Se evalúa muy poca cantidad de
muestra
•Sensibilidad y especificidad limitada.
DIAGNOSTICO
Examen directo
3. Método de concentración de parásitos

• Fundamento:
• Aplicables cuando el N° de parásitos presentes en la
muestra pueda ser limitado, hace posible que se detecten
parásitos que están presentes en escaso número.
• Siempre debe ir acompañado de un examen directo.

• Objetivo:
• Aumentar la sensibilidad de análisis parasitológico.
3. Método de concentración de parásitos
•Permite corroborar el hallazgo del método directo.
•Permite conocer la intensidad del parasitismo.
•Detectan 40 % - 50% más que el Método Directo.
•Permiten evaluar una mayor cantidad de muestra.
•Su sensibilidad y especificidad es notablemente mayor que
el examen directo.

PUEDE SER:
•Por FLOTACION.
•Por SEDIMENTACION (tubo, vaso).
•Por COMBINACION DE AMBOS METODOS
3. Método de concentración de parásitos
• Dilución minuciosa de heces en líquido o solución de
densidad:
• Inferior a la de los parásitos (Técnicas de sedimentación)
• Superior a la de los parásitos (Técnicas de flotación)

• Ventajas:
• Realización muy simple
• Precisan poco material

• Inconvenientes:
• Procesos largos
• Exigen mucha manipulación
• No aplicables a series grandes de muestras
3. Método de concentración de parásitos
Pasos previos a la realización de cualquier método de concentración
bien sea por Flotación o Sedimentación.

PASAR A TRAVES
DE UNA GASA

HECES

HOMOGENIZAR FILTRAR
Homogeneizar 2 a 5 gr de heces (10-20 gr) en 10 ml de SF o agua.
Colocar la dilución en tubo cónico de 50 ml, filtrando a través de gasa .
3. Método de concentración de parásitos
a. Por sedimentación

Basados en la utilización de suero fisiológico (SF) y otras soluciones


de baja densidad.
Se recuperan huevos, larvas, ooquistes y quistes del fondo de un tubo
en el que se depositan por ser más densos.
3. Método de concentración de parásitos

a. Por sedimentación

• SEDIMENTACIÓN SIMPLE
• Lentos y poco prácticos
• Mayor utilidad para huevos de tremátodos

• SEDIMENTACIÓN /CENTRIFUGACIÓN
• Se destaca el método de Ritchie(con formol y éter o
acetato de etilo), que es el más usado en los laboratorios
de nuestro medio
a. Por sedimentación
• Método de RITCHIE
Se basa en la concentración de los
quistes y huevos por sedimentación
mediante la centrifugación, con la
ayuda de formol y éter para separar
y visualizar los elementos
parasitarios.

El formol fija y conserva las muestras.


El éter disuelve las grasas.
La [ ] se hace por centrifugaciones
sucesivas.
Ventaja: concentra y no deforma las
formas parasitarias, permite el transporte
y almacenamiento de muestras
Desventajas: laborioso.
3. Método de concentración de parásitos

b. Por Flotación

Los elementos parasitarios se recogen de la superficie de un


líquido denso al cual ascienden por su menor peso específico.
3. Método de concentración de parásitos
b. Por Flotación
• Método de Faust o de sulfato de Zinc 33%. Los quistes y/o
huevos de los parásitos flotan en la superficie por ser de
menor densidad. Útil para detectar huevos de
helmintos.

• Método de Willis Molloy o de solución saturada de NaCl:


Útil para detectar quistes de protozoarios y huevos de
helmintos.
b. Por Flotación
• Método de Sucrosa de Sheather: Método de
concentración por flotación con centrifugación en una
solución de azúcar.
• Esta técnica es útil para la concentración de quistes y
ooquistes de protozoos y huevos de helmintos
• Se usa como método preferencial en el diagnóstico
de coccidios: Cryptosporidium, Cyclospora,
Isospora.
c. Otros métodos
• Método de BAERMANN : Método de concentración por
migración. Muestras seriadas aumenta sensibilidad.
• Objetivo: recuperación de larvas rabditiformes de
Strongyloides Sp.
c. Otros métodos
• Método HARADA MORI: Cultivo y aislamiento de larvas
4. Métodos cualitativos y cuantitativos

• Método cualitativo: Técnica de Kato o método de


concentración por tamizado (huevos de helmintos y algunos
protozoarios). Consiste en la aclaración de las heces con el
uso de glicerina, que permite preparar una capa
transparente y observar las formas parasitarias

• Método cuantitativo de KATO KATZ (Análisis cuantitativo=


hpg (cuantifica la presencia de huevos de helmintos)
Técnica de Graham
• Observación microscópica del material recogido de la zona perianal,
por aplicación de una superficie adhesiva.
• La cinta se dispone sobre un soporte rígido, con la superficie
adhesiva hacia el exterior.
• Se aplica varias veces sobre la piel de la región perianal sin introducir
en el recto.
• Se envía al laboratorio y se observa al microscopio (10X).
• Realizar la toma de muestra a 1ª hora por la mañana, antes de
levantarse de la cama, durante 3 mañanas consecutivas
5. Coloraciones
• Coloraciones temporarias
• Lugol, Tionina, Azul de metileno

• Coloraciones permanentes (Frotis)


• Ziehl Neelsen modificado o Kinyoun para diagnóstico de
coccidiosis intestinales (Criptosporidiosis, Isosporosis,
Ciclosporosis)
• Hematoxilina Férrica: colerea protozoos, amebas y flagelados
• Tricrómica: colorea estructuras internas de los protozoos
• Tricrómica y Gram Cromotrope para microsporidiosis
5. Coloraciones
• Coloraciones permanentes
PROTOZOARIOS INTESTINALES

ENTAMOEBA HISTOLYTICA

• Cuadro clínico : disentería amebiana y absceso hepático

• Examen microscópico de heces o aspirado de abceso brinda una


efectividad máxima de 50 % (trofozoitos y quistes)

• Detección de antígenos por ELISA en heces y suero efectividad de


95%

• PCR en heces o aspirado de absceso (efectividad mayor de 95 %)


HELMINTOS INTESTINALES
CUADRO CLINICO:
• Es variable dependiendo del parasito ( asintomático, diarrea,
estreñimiento, dolor abdominal, malabsorción )

EXAMEN MICROSCOPICO DE HECES : se observan larvas y/o


huevos

• Es el mas importe si se realiza adecuadamente.


• Se pueden observar huevos de Fasciola hepática en pacientes
que han ingerido hígado de vacuno contaminado ( instruir al
paciente )
• No hay diferencias morfológicas en estadio de huevo entre T.
Solium y T. Saginata . Importante la identificación por otros
métodos como examen de proglotidos .
• Test de Graham o cinta adhesiva se realiza para observación de
adultos y huevos de Enterobius vermicularis.
HELMINTOS INTESTINALES
DIAGNOSTICO SEROLOGICO

• Debido a que la mayoría de estos parásitos están


localizados en el lumen intestinal no inducen a respuesta
inmunológica y formación de anticuerpos . Por este
motivo no se han desarrollado pruebas serológicas. Se
dispone para strongiloides, hidatidosis, cisticercosis.

• No son muy confiables.


HELMINTOS INTESTINALES
STRONGILOIDES STERCORALIS

CUADRO CLINICO : variable


• Diarrea Crónica intermitente. Se investiga en casos de eosinofilia
marcada. Sangre oculta en heces (Thevenon positivo). Anemia
Crónica. Lesiones cutáneas sugestivas de larva migrans.
Procedencia de zonas endémicas.

EXAMENES MICROSCOPICOS
• Los métodos convencionales no dan resultados
• Realizar estudios seriados de materias fecales, la irregularidad en la
salida de las larvas dificulta el diagnóstico.
• Métodos de concentración
STRONGILOIDES STERCORALIS

PRUEBAS DE MIGRACIÓN DE LARVAS


• Cultivo en placa de agar
• Método de Harada – Mori
• Método de Baermann

PRUEBAS SEROLÓGICAS
• La detección de anticuerpos no es una prueba de rutina
• ELISA en suero es el recomendado y hay métodos
disponibles con sensibilidad mayor de 90 %.
PARÁSITOS HÍSTICOS
MALARIA

EXAMEN MICROSCOPICO:
• Es el método más importante en el diagnóstico. Se realiza
mediante la gota gruesa y se tiñe con colorante Giemsa.
• Para la identificación de los elementos parasitarios se
requiere de personal capacitado y con experiencia.
MALARIA
DIAGNÓSTICO SEROLOGICO Y MOLECULAR

• Pruebas rápidas de detección de antígenos (PRD). Tener


en cuenta la marca del reactivo (Certificación ISO, CE,
OMS, FDA, etc.)

• ELISA y el IFI para estudios epidemiológicos.

• PCR es casos específicos (Malaria + HIV)


LEISMANIASIS
EXAMEN MICROSCÓPICO

• Se examinan muestras de biopsia de lesiones y/o de sangre periférica.


• Las muestras se colorean con Giemsa, Hematoxilina Eosina
(Rendimiento 50 % a 60 % ) .
• La inmunohistoquimica mejora la sensibilidad,

CULTIVO

• Medio utilizado NNN. No se realiza de rutina . Requiere de laboratorio


especializado. Permite la identificación bioquímica y la sensibilidad a
fármacos.
DIAGNÓSTICO SEROLOGICO

Se disponen de técnicas de serológicas de alta sensibilidad


como IFI, ELISA, Inmunoblot. El inconveniente es que en las
zonas endémicas la población tiene anticuerpos debido a
infecciones subclínicas.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Se disponen de numerosas métodos de PCR para la detección


de ADN de leishmania. Se puede procesar diversidad de
muestras. La sensibilidad es cercana al 100%. El factor
económico es el limitante.
TRIPANOSOMIASIS ( ENF. DE CHAGAS )
CONSIDERACIONES PREVIAS
• Para un adecuado diagnóstico de laboratorio es
indispensable determinar en que etapa de la
enfermedad se encuentra el paciente (aguda o
crónica). Información clínico epidemiológica.

• En la etapa aguda se emplean técnicas para la


detección o visualización del parasito

• En la etapa crónica se detectan anticuerpos específicos


contra el Trypanosoma cruzi
TRIPANOSOMIASIS ( ENF. DE CHAGAS )
MÉTODOS DIRECTOS

DIAGNÓSTICO MICROSCÓPICO
• Consiste en la observación del parasito
(trypanomastigotes) en sangre periférica donde son
abundantes en la fase aguda.

• Se realiza mediante el método de gota gruesa o frotis


sanguíneo. Se tiñe con colorante Giemsa.
TRIPANOSOMIASIS ( ENF. DE CHAGAS )

• Los métodos de Strout y del Tubo Capilar mejoran la


posibilidad de visualización porque concentran los
elementos parasitarios
TRIPANOSOMIASIS ( ENF. DE CHAGAS )
METODOS SEROLOGICOS

• Durante la fase aguda se investigan anticuerpos tipo IgM


y en la fase crónica tipo IgG que permanecen de por vida.

• Los métodos empleados son IFI, Hemaglutinación y


ELISA. Estas pruebas son muy sensibles y presentan
reacciones cruzadas con leishmaniasis, malaria, sífilis,
toxoplasmosis, etc.

• Empleando antígenos purificados o recombinantes se


disminuyen las reacciones cruzadas.
XENODIAGNÓSTICO Y CULTIVO
• Se emplean triatominios que no sean portadores de parásitos
para que ingieran sangre del paciente. Si el paciente esta
infectado el triatominio eliminara tripomastigotes por las heces.
El examen de las heces del triatominio se realiza durante tres
meses.

• Durante la fase aguda y crónica se pueden realizar


hemocultivos. En la fase crónica se inocula al medio de cultivo
( NNN ) mayor cantidad de sangre. Semanalmente se revisa
una gota del medio inoculado para detectar la presencia de
epimastigotes.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR

• Se dispone de numerosos métodos para la detección


del genoma de T. cruzi por PCR.

• Estos protocolos no son comercializados y solo se


emplean en Laboratorios Referenciales.

• Son útiles en el diagnóstico y evolución de la enfermedad


así como en la evaluación del tratamiento.