INMOVILIZACION Y

ESTABILIZACION DE ENZIMAS
INDUSTRIALES
 LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES
EN LA INDUSTRIA QUIMICA

Enzimas para
Industria
Enzimas La industria
Química
Química

MODIFICACIÓN y MEJORA DE SUS PROPIEDADES

CIENCIAS DE
LA BIOTECNOLOGIA E INGENIERIA ENZIMATICA
1
 INMOVILIZACION DE ENZIMAS
Enzima soluble Enzima inmovilizada

S +E S E
 Re-uso ó uso continuo
 Mejor control de la reacción
 Proceso mas sencillo y mas limpio
 Enzima-electrodo 2
BIOTECNOLOGIA ENZIMATICA DE SUPERFICIES

+E E
Soporte

+  Conservar o aumentar
la actividad
 Mejorar la estabilidad
 Mejorar la selectividad

5
 INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS
DE INMOVILIZACIÓN Y POST-INMOVILIZACION
Mejorar notablemente
las propiedades del biocatalizador

 Cual es la región que participa en la inmovilización

 Cuantos residuos participan en la inmovilización
 Utilización de brazos espaciadores
 Modificación química adicional
 Modificación física adicional

3
INGENIERIA DE ENZIMAS INDUSTRIALES

ESTABILIZACION

REACTIVACION

HIPERACTIVACION

ALTERACION DE ESPECIFICIDAD
 ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACION
DE ENZIMAS POR INMOVILIZACION
COVALENTE MULTIPUNTUAL

 Muchos residuos de la enzima

 Brazos espaciadores muy cortos
 Soporte rígido

Posiciones relativas invariables durante cualquier cambio conformacional

inducido por cualquier agente distorsionarte

ESTABILIZACION 3D 6
COMO CONSEGUIR ESTE TIPO DE INMOVILIZACIONES??
LA MORFOLOGIA DEL SOPORTE

7
 LOS BRAZOS ESPACIADORES

O
OH + O CH2 CHOH CH2OH
CH2 CH CH2OH

O
IO -
4
O CH2 C + NH2 E O CH2 CH N E
H
9
 LOS RESIDUOS Y LA REGION

..
- NH2 (muy buen nucleófilo sin necesidad de activación)

Los grupos amino: un amino terminal muy reactivo

y numerosos residuos lisina poco reactivos

La región : a.- el amino mas reactivo

b.- las mas ricas en grupos amino

8
 + NH+
INMOVILIZACION DE ENZIMAS NH3 3
+
A TRAVES DE SUS GRUPOS AMINO NH 3

H2N
H2N R’
+ H2N R

O
O CH2 C + H2N R
H
LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS
Y SOPORTES GLIOXIL
NH2 NH2

H2N

H2N

H2N
H2N
pH 8.0 (NO)
pH 10.0 (NO)
NH2

H2N
Regiones muy ricas
H2N en grupos aminos
H2N
H2N
pH 10.0 (SI)
10
Orientacion correcta: regiones muy ricas en aminos

 No inmoviliza soportes muy activados a pH 7.0

 No inmoviliza soportes poco activados a pH 10.0
 Inmovilizacion muy rapida sobre soportes muy activados a pH 10.0
 Inmovilizacion muy rapida de tripsina (autolisada) sobre soportes
muy activados a pH 7.0
 Efecto espectacular de la concentracion de grupos activos
sobre la velocidad inmovilización
 Efecto espectacular de la temperatura sobre la
velocidad de inmovilización
 Estabilización muy elevada de todas las enzimas evaluadas

glioxil muy diferente de BrCN, glutaraldehido…

61
EL PROCESO DE MULTI-INTERACCIÓN ENZIMA - SOPORTE

.........

Tiempo hasta 72 horas después del final de la primera inmovilización

Temperatura (25 ºC >>> 4 ºC)
11
PUNTO FINAL DE LA MULTI-INTERACCION ENZIMA-SOPORTE

O
O CH2 C O CH2 CH2OH
H

O CH2 CH N O CH2 CH2 NH

N
NaBH4
O CH2 CH O CH2 CH2 NH
1mg/ml
O CH2 CH N
O CH2 CH2 NH

O
O CH2 C O CH2 CH2OH
H

12
 LOS GRUPOS GLIOXIL: SOPORTE-O- CH2 - CHO

 Muy estables y muy cercanos al soporte rígido

 Reacción unipuntual reversible con grupos amino

a.- orientación adecuada para inmovilización multipuntual
b.- multi-interacción no distorsionarte
 Ausencia de impedimentos estéricos
O
..
O CH2 C NH2
H

 Modificación química mínima

+ +
E NH3 E NH2 CH2 CH2 O

 Soportes completamente inertes e hidrofílicos

13
 SOPORTES GLIOXIL PARA LA ESTABILIZACION DE ENZIMAS

O
O
C
C
O H
H
C O O
H
C C
O
H H
C O
H
C
H

alta densidad superficial de grupos glioxil, µEq. / m2

 Soportes formados por grandes superficies con un elevado grado de activación
 Brazos espaciadores muy pequeños
 La enzima se inmoviliza siempre por regiones muy ricas en NH2
 Los grupos glioxil son muy estables y no tienen impedimentos estéricos
durante la multi-interacción
 La modificación química de la enzima es mínima
14
 ENZIMAS ESTABILIZADAS
POR INMOVILIZACION MULTIPUNTUAL SOBRE SOPORTES GLIOXIL

ENZIMA ACTIVIDAD ESTABILIZACION

Tripsina 75% 10.000

Quimotripsina 70% 60.000
Penicilina G acilasa de E. Coli 70% 8.000
Penicilina G acilasa de K. citrophila 70% 7.000
Ferredoxina NADP reductasa de Anabaena 60% 1.000
Lipasa de C. rugosa 50% 150
Glutamato racemasa 70% 1.000
Esterasa de B. stearothermofilus 70% 1.000
Termolisina de B. thermoproteolyticus 100% 100

>>>
estable

<<
16
UNION MULTIPUNTUAL TRIPSINA (AMIN0)- 6% AGAROSA (GLIOXIL)

Descenso del 50% en residuos lisina

 una media de 7 enlaces por molécula de tripsina

RIGIDEZ
HIDRÓLISIS DE BAEE ACTIVIDAD %
ACTIVIDAD, % 200
100

150

100
50

50

0
0 0 20 40 60 80
0 2 4 6 8
ETANOL, %
UREA, M
DERIVADO UNIPUNTUAL

DERIVADO MULTIPUNTUAL ESTABILIZACION

ESTABILIZACIÓN TERMICA= 10.000
ACIVIDAD INTRINSECA = 75% 18
ESTABILIZACIÓN DE Ferredoxin NADP reductasa
POR UNION COVALENTE MULTIPUNTUAL

condiciones experimentales Estabilización

pH 7.0 , 60ºC 600
pH 10.0 , 30ºC 200
pH 5.0, 70 ºC 200
pH 7.0 , 25 ºC, 50 % etanol 2000
pH 7.0 , 25ºC, etil acetato 500

Estabilidad
comparada con el derivado unipuntual
15
 INMOVILZIACION DE ENZIMAS SOBRE
GELES GLIOXIL Y SOBRE OTROS SOPORTES CONVENCIONALES

inactivacion inactivacion de derivados de

de derivados de PGA lipasa de c. antarctica

glioxil

glioxil

glutaraldehido
bromocianogeno

17
 ESTABILIZACION DE ENZIMAS
POR INMOVILIZACION COVALENTE MULTIPUNTUAL
SOBRE SOPORTES GLIOXIL

Actividad – estabilidad excelente

para muchísimas enzimas y todas las condiciones

 Los mejores resultados reportados en la literatura

Protocolos de inmovilización muy sencillos

 Problema académico árido y multidisciplinar

 No se puede “ver” lo que ocurre 19

 REACTIVACION DE ENZIMAS INMOVILIZADAS
DESPUES DE SU INACTIVACION POR DISOLVENTES

pH 7.0, 25ºC
90% dioxano

agua ??

 Estructura primaria intacta

 Puentes disulfuro intactos
 Unión covalente multipuntual
 Superficie del soporte inerte (-OH)
62
REACTIVACION RAPIDA Y COMPLETA

replegamiento
desplegamiento
Disolventes pH 7.0
Urea
Uso industrial 25ºC
guanidina
agua

64
REACTIVACION DE ENZIMAS INMOVILIZADAS - ESTABILIZADAS
DESPUES DE SU INACTIVACION POR DISOLVENTE
QT EN 90 % DIOXANO
Actividad residual, (%)

Medio acuoso

8M Guanidina

Tiempo (dias)
inactivación total reactivación 24 h.
reactivación 30 min. desplegamiento- replegamiento
ESTABILIZACION DE ENZIMAS MULTIMERICAS

IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADES
O

C
H

ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES

(poli aldehídos)
20
 INACTIVACION  -aminoácido ester hidrolasa

Actividad residual,(%)

Tiempo, (horas)
5mM de fosfato sódico pH 6,5; 25ºC
Concentración de proteína 5 g / ml
21
REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS MULTIMERICAS
ESTABILIZADAS EN CONDICIONES DISOCIANTES

36
EFECTO DE LA ESTABILIDAD DEL DERIVADO EN LA REACCION
DE SINTESIS DE AMPICILINA CATALIZADA POR
 -aminoacidoester hidrolasa

Rendimientos de síntesis de ampiccilina

óptima

estándar

“óptima”

37
tiempo, min

Condiciones estandar: 25 mM fosfato pH6,5; 4ºC

Condiciones óptimas: 40% metanol pH 6,5 4ºC; ausencia de fosfato
 ESTABILIZACION DE ENZIMAS FRENTE A DISOLVENTES
GENERACION DE MICROAMBIENTES HIPERHIDROFILICOS

NH3+
Enzima mas rígida
Menor concentración de disolvente
SO4=
en el micro-entorno de la enzima

Polietilenimina + dextrano sulfato  poli [ NH4 (SO4)2]

23
 INACTIVACION DE PGA INMOVILIZADA POR
DISOLVENTES ORGANICOS
100
Actividad residual, (%)

75

50

25

0
0 200 400 600 800 1000
Tiempo (horas)
95% dixano, pH 7, 25ºC
24
UTILIZACION DE DEXTRANOS COMO BRAZOS ESPACIADORES

OH HO

OH OH
OH
OH
OH

 enzima casi-idéntica a la enzima soluble

 ningún efecto “negativo” de la proximidad de la
superficie del soporte

a.- enzimas sobre substratos macromoleculares

b.- cromatografía de afinidad proteína - proteína
22
c.- proteómica (proteína-proteína, proteína-ADN..)
 INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS DE
INMOVILIZACION Y POST-INMOVILIZACION

Orientación // rigidez // brazo espaciador // modificaciones post-inmovilización

+
+ +
+ +
+

+
25
PURIFICACION DE GUANIDINO BENZOATASA POR
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD SOBRE
LIGANDOS CON CARGA POSITIVA

+
+
- +
+
- +
+ -
+
+ -
+
+

Intercambio iónico Impedimentos estéricos para

de numerosas proteínas la afinidad de la proteína “diana”

Cromatografía
de afinidad
selectiva y eficiente
+ Muy baja densidad de ligandos
Brazos espaciadores
Interacción fármacos y
Biomacromoleculas 43
 PROCESOS RELACIONADOS:
BIOTECNOLOGIA DE SUPERFICIES

 Anticuerpos (orientaciones correctas)

 Sondas de ADN (alteración nula)
 Polisacáridos (alteración mínima)

 Placas multipocillo
 Partículas magnéticas
 Porta-muestras para “chips de ADN”

Diagnostico

Análisis alimentos
49
Análisis de agua
 INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS
DE INMOVILIZACION Y POST-INMOVILIZACION

 Resultados espectaculares
(estabilidad, actividad, selectividad)

 Protocolos experimentales muy sencillos

 Ingeniería multidisciplinar:
biotecnología de superficies + polímeros

 Los cambios estructurales “no se pueden ver”

 Avance un “poco árido”

sobre una serie de evidencias experimentales...
39
 Microbiología y biología molecular

INGENIERIA DE LA ENZIMA

Purificación, inmovilización, estabilización, hiperactivación,

mejora de la selectividad, reactivación
Actividad Estabilidad
biocatalizador biocatalizador

Solubilidad
pH
Selectividad
biocatalizador
Ingeniería
substratos y
productos temperatura
codisolventes
de la
Rendimientos reacción
síntesis/hidrólisis
Medio
ambiente
enzimática
Estabilidad de
substratos

Química orgánica 53
 BIOTECNOLOGIA ENZIMATICA

Búsquedas de
Mejora de enzimas
Nuevos enzimas
existentes

Inmovilización purificación estabilización

Ingeniería de la reacción

Ingeniería del reactor

Análisis, alimentos, química orgánica, medio ambiente,…

PROCESOS INDUSTRIALES CATALIZADOS POR ENZIMAS

 Biotecnología enzimática
 Multidisciplinaridad
 Enfoque integrado

 Microbiología  Ciencia de Materiales

 Biología Molecular  Química de Proteínas

Biotecnología de Superficies
 Química analítica
 Bioquímica
 Química orgánica
 Biofísica
 Ingeniería química

PROCESO QUIMICO INDUSTRIAL

CATALIZADO POR ENZIMAS
 IMPLANTACION DE ENZIMAS COMO
CATALIZADORES INDUSTRIALES

Mejora de
Mejora de Enzimas ingeniería
enzimas por de la
por técnicas de reacción
métodos inmovilización y del
biológicos y reactor
post-inmovilización
 MEJORA DE LAS PROPIEDADES
DE UNA ENZIMA INDUSTRIAL

NATURALEZA
•Seres vivos extremófilos

•ADN ambiental

Mutagénesis Mutagénesis
al azar dirigida

Inmovilización - más sencillas

+ - más efectivas
Post-inmovilización

PROCESO QUIMICO CATALIZADO POR UN ENZIMA