Rapid Analysis of Amphetamine,

Methamphetamine, MDA, and MDMA

in Urine Using Solid-Phase
Microextraction, Direct On-Fiber
Derivatization, and Analysis by GC-MS
Disusun oleh :
Farmasi 3B
Anggota :
• Futuh Nur Irfaniah (31116066)
• Gita (31116069)
• Resti Azkiya Rahmati (31116083)
• Yani Febri Rusmayani (31116099)
Abstrak
 Pendahuluan
Amphetamine
Stimulan sistem saraf pusat yang kuat
Amfetamin yang paling umum tersedia adalah phetamine dan
methamphetamine, yang digunakan untuk mengobati depresi ringan, obesitas,
dan narkolepsi.

Tujuan Penelitian
Untuk mengembangkan metode cepat, andal, dan efektif untuk
penentuan stimulan Amphetamine, Methamphetamine, MDA, dan
MDMA dalam sampel urin. Menggunakan headspace-SPME, on-
fiber headspace derivatisasi, dan analisis dengan gas
chromatography-mass spectrometry (GC-MS).
 Metode yang Digunakan
SPME (Solid Phase Microextraction)
Teknik ekstraksi di mana analit diadsorpsi
secara langsung dari sampel ke serat
leburan-silika yang dilapisi dengan fase
diam yang tepat.

GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry)

Metode pemisahan senyawa organik yang
menggunakan dua metode analisis senyawa yaitu
kromatografi gas (GC) untuk menganalisis jumlah
senyawa secara kuantitatif dan spektrometri massa
(MS) untuk menganalisis struktur molekul senyawa
analit.
 Eksperimental
Bahan dan Reagen
- Amfetamin
- Metamfetamin
- MDA
- MDMA
- Larutan standar amphetamine-d 3 ( dalam 100
μg/mL dalam etanol )
- Trifluoracetic dan hidrida ( TFA )
- NaCl
- NaOH
 Metode Headspace-SPME
1 mL urin dan 50 μl standar internal deuterasi
yang mengandung amphetamin-d3 pada 10
mg/mL ditempatkan ke dalam botol
headspace 5 mL.
Sampel ( alkalin ) kemudian tambahkan
50 μl 2N NaOH dan 0,5 gram NaCl unruk
meningkatkan penguapan senyawa
amfetamin .

Kemudian botol disegel dengan rapat

Setelah 10 menit perangkat SPME dan dipanaskan pada suhu 100ºC dengan
dimasukkan melalui spetum botol dan menggunakan pemanas Multi-Block
serat itu terpapar diruang utama selama (model 2050-1, Lab-Line Instrumen, Inc.,
10 menit lagi. Melrose Park IL )

Jarum kemudian dihapus dan dimasukkan kedalam ruang utama Setelah 20 menit eksposisi
dari botol tertutup yang lain yang mengandung TFA dan dalam fase gas TFA, serat itu
dipertahankan pada suhu 60ºC untuk mendapatkan turunan secara termal diserap di port
trifluoroasetil dari komponen amfetamin yang ada didalam injeksi GC selama 5 menit.
sampel.
 Metode GC-MS
Sistem GC-MS terdiri dari Hewlett-Packard
(Palo Ato, CA) dalam GC digabungkan ke
dalam Mass Selective Detector (MSD), yang Tegangan pengali elektron diatur pada
dioperasikan dalam mode pemantauan ion 400eV diatas tegangan autotune
yang dipilih (SIM).

Suhu oven diadakan pada suhu 60ºC selama 1

menit kemudian diprogram menjadi 100ºC pada GC dilengkapi dengan kolom kapsul HP-
40ºC/menit, sampai 200ºC pada 15ºC/menit dan Ultra 1 (silikon crosslinked, ram 25 m x
akhirnya sampai 290ºC pada 40ºC/menit dan 0,2 ram, ketebalan film 0,33 μl).
diadakan pada suhu ini selama 5 menit.

Suhu injeksi dan GC-MS antarmuka masing-masing

250ºC dan 280ºC masing-masing helium digunakan
sebagai gas pembawa dengan laju alir 1 mL/menit.
Ion yang dipilih dan Waktu Retensi
 Hasil dan Diskusi
1. Pemulihan
Pemulihan mutlak dari analit di hasilkan
oleh perbandingan pada bagian daerah
puncak dari kontrol urin, dengan nilai n = 6
untuk setiap konsentrasi yang di uji.
Sehingga dengan daerah puncak yang
diperoleh ketika analit standar murni
diuapkan sampai kering dan diderivatisasi
dengan TFA (Trifluoroacetic anhydride).
Perkiraan Pemulihan Mutlak dan Relatif untuk Amphetamine-
d3 dari Amphetamine, Methamphetamine, MDA, and MDMA
dari Sampel Urin pada Tiga Konsentrasi yang berbeda
 Karena amfetamin-d3 digunakan sebagai
satu-satunya I.S (Internal standard) untuk
semua analit, pemulihan relatif dengan
amfetamin-d3 karena I.S juga diukur.
Tabel II menunjukkan data pemulihan untuk
empat senyawa yang digunakan dalam
penelitian ini pada konsentrasi rendah (50
ng/mL), konsentrasi sedang (100 ng/mL) dan
konsentrasi tinggi (500 ng/mL). Hasil
menunjukkan pemulihan lebih besar dari 70%
untuk semua analit yang telah ditentukan.
 Korelasi antara Persentase Pemulihan dari Amphetamine,
Methamphetamine, MDA, MDMA, dan I.S. (Amphetamine-d3)
dengan Suhu yang berbeda dalam Metode Headspace-SPME
2. Linearitas
Linearitas dibuat untuk semua empat senyawa
dengan kurva kalibrasi standar kisaran dari 50
ng/mL sampai 1000 ng/mL. Kurva kalibrasi
disiapkan dengan menambahkan standar murni ke
dalam urin kosong untuk mendapatkan
konsentrasi 50, 100, 250, 500, 750 dan 1000
ng/mL.
Sampel yang dianalisis sesuai dengan metode
yang digunakan, kurva diperoleh dengan memplot
rasio luas puncak (analit/amfetamin-d3) terhadap
konsentrasi.
Persamaan Regresi, Koefsien Korelasi, dan Batas
Deteksi (LOD) dan Kuantitasi (LOQ)
Persamaan regresi linier tunggal dan koefisien
korelasi ditunjukkan pada tabel III, dihitung
menggunakan paket perangkat lunak grafik
microsoft. Koefisien korelasinya antara 0,9946
dan 0,9999. Batas kuantisasi pengujian adalah 10
ng/mL untuk amfetamin dan metamfetamin,
untuk MDA (3,4-methylenedioxyamphetamine)
dan MDMA (3,4-methylenedioxymethampheta
mine) adalah 20 ng/mL.
3. Presisi dan Akurasi
Ketetapan intra dan interassay dari metode analisis
ditentukan dengan menganalisis tiga konsentrasi yang
berbeda (50, 100 dan 500 ng/mL) dari sampel urin
dalam batch. Ketepatan intra-assay dengan
menganalisis sampel (n=6) setiap hari, sedangkan
analisis untuk ketepatan interassay dilakukan setiap
bulan selama periode empat bulan (n=4 per bulan).
Akurasi dievaluasi dengan membandingkan
konsentrasi analit yang di uji untuk sampel presisi intra
dan interassay dengan konsentrasi lebih. Data
(koefisien variasi dan akurasi) untuk setiap pengujian
dapat diterima, ditunjukkan pada tabel IV.
Ketepatan Intra-assay dan Interassay dan Akurasi
Metode pada Tiga Konsentrasi yang Berbeda
 Derivatisasi
Derivatisasi terletak pada penerapan metodologi
headspace untuk melakukan ekstraksi dan
derivatisasi semua senyawa yang terlibat dalam
penelitian.
Derivatisasi ditunjukkan dengan membandingkan
chromatogram dari underivatized (batch A) dan
derivatisasi (batch B)
Turunan trifluoroacetamida (Gambar 2B) memiliki
bentuk puncak yang lebih baik, lebih besar resolusi,
dan kelimpahan yang lebih tinggi dari pada
campuran underivatization (Gambar 2A).
Pengaruh Derivatisasi
• Derivatifisasi dengan reagen HFBA dapat
menyebabkan kerusakan pada alat fase kolom
dan dengan demikian menghasilkan setengah
kolom yang lebih pendek.
• Sililasi headspace untuk analisis metabolit
hidrokarbon menggunakan BSTF dengan
pertimbangan volatilitas agen derivat
terfluorinasi.
• memilih TFA karena ini adalah yang paling
reaktif dan mudah menguap dari semua
anhidrida fluorinated.
• Kami membandingkan keampuhan derivatisasi
pada 50°C, 60°C, 70°C, dan 80°C.
• Suhu 60°C dipilih karena itu adalah suhu
terendah yang memungkinkan derivatisasi
lengkap untuk semua senyawa.
• Derivatisasi dimulai ketika serat SPME terkena
headspace TFA pada 60 ~ dan berakhir di
suntikan port dari sistem GC. Waktu
pencahayaan 5 menit di port injeksi GC.
Perbandingan antara metode SPME dan SPME-
headspace dilakukan dengan cara :
• Batch A, menggunakan metode ekstraksi
headspace.
• Batch B, 2 mL urin ditambah I.S. ditempatkan
ke dalam botol dan alkalin dengan 50 mikro
liter 2N NaOH.
Persentase Pemulihan Kedua Metode
Serupa
Gambar 3 :
Menunjukkan kromatogram setelah menyuntik
kan kedua batch. metode headspace karena
chromatograms lebih bersih. Selain itu, waktu
paruh serat polydimethylsiloxane lebih panjang
karena tidak pernah berhubungan dengan
matriks biologi.
 Kesimpulan
Metode untuk analisis simultan amfetamin,
metamfetamin, MDA, dan MDMA dalam sampel
urin telah dikembangkan dan divalidasi
menggunakan headspace-SPME diikuti oleh
headspace on-fiber derivatisasi dan analisis oleh
GC-MS. Dan telah terbukti, sederhana, hanya dua
langkah yang dilewati; cepat, hasil kuantitatif
dimungkinkan dalam waktu kurang dari 55 menit;
sensitif, LOQs adalah 10 dan 20 ng / mL; dan
spesifik, analisis dilakukan oleh GC-MS setelah
derivatisasi. Metode ini telah terbukti cocok untuk
aplikasi analisis rutin di laboratorium forensik.