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FACULTAD DE MEDICINA

CITOLOGÍA Y GENÉTICA
“Técnicas citológicas e histológicas”

Dra. Ada del Carpio S.


TÉCNICAS CITOLÓGICAS E
HISTOLÓGICAS
 Son procedimientos,
recursos o métodos de
laboratorio que
permiten preparar
células, tejidos o
fracciones celulares
para su
reconocimiento o
estudio.
TÉCNICAS CITOLÓGICAS E
HISTOLÓGICAS
 Clasificación:

 Técnicas corrientes o rutinarias: Sirven para


examen inmediato o mediato

 Técnicas especiales.
Examen directo o inmediato de
células o tejidos vivos
 Se utiliza Los M/O, de campo claro, especialmente los
M. de Contraste de Fase o Interferencia. (Observación
de Glóbulos rojos, protozoarios, algas, etc.)

 La coloración vital: Se introduce en el organismo


colorantes no tóxicos. Ej. Azul de tripán, azul pirrol,
etc.
Examen directo o inmediato de
células o tejidos vivos

Protozoario Vorticela
Coloración vital
Paramesium Vorticela
Técnicas corrientes o rutinarias
Examen del Material fijado: Frotis de Celulas ,Cortes de
Tejidos u Organos (examen mediato) al MO y ME
 Técnica para MO:
 Obtención de la muestra
 Fijación (Fijadores:formol al 10%, alcohol absoluto y
mezclas fijadoras: Bouin (ácido acético, ácido pícrico,
formol), Zenker (bicromato de potasio, bicloruro de
mercurio, ácido acético), etc.
 Corte : Lavado, deshidratación, aclaración, inclusión
en parafina, confección de los bloques.
 Coloración: Hidratacion Gradual Aclaramiento
 Montaje
Preparacion de Celulas
Descamadas de la Mucosa Oral
Inclusión en parafina
Inclusión en parafina

Procesador de muestras Batería para deshidratación


de la muestra
Inclusión en parafina

Confección del bloque Corte al Micrótomo


Inclusión en parafina

Obtención de cortes con Recojo de muestras en


parafina portaobjetos
Coloración corriente: H.E.

 Procedimiento:
 Desparafinado de los cortes con xilol.
 Hidratación gradual. Alcohol de 100%, de 95%, agua
destilada.
 Coloración con hematoxilina. Tiñe los núcleos de color
azul o púrpura oscuro.
 Lavado en agua corriente y viraje.
 Coloración con eosina del citoplasma.
 Deshidratación gradual.
 Aclarado en xilol.
 Montaje con bálsamo de Canadá.
Coloración corriente: H.E.

Batería de coloración Batería de deshidratación y


aclaración
TÉCNICA PARA LAS PREPARACIONES A
USARSE CON EL ME.
 Obtención de las muestras

 Fijación
Los fijadores más utilizados son el tetraóxido de osmio y el
glutaraldehído, las muestras a fijarse deben ser muy pequeñas en
forma de cubos de 1 a 2 mm de lado.
 Corte
Los cortes deben tener un espesor de 20 a 100 nm

 Coloración
Vapores o soluciones de metales pesados como el acetato de
uranilo o el hidróxido de plomo.
El ácido ósmico, usado como fijador, también actúa como
“colorante”, el ácido fosfotúngstico, sombreado con vapores de
oro o platina.
Técnica para la obtención
de muestras al ME
TÉCNICAS ESPECIALES:
 Métodos o procedimientos que se utilizan en trabajos de investigación
de Biología Celular. Las hemos subdividido en técnicas especiales para
la observación de células vivas y técnicas de citoquímica e
histoquímica.

1. Observar células vivas:.

 Exteriorización y transiluminación de órganos:


 Circulación en elmesenterio, ovulación

2. Cámaras transparentes:
 C,amara anterior del ojo ´transplate de tejidos
TÉCNICAS ESPECIALES:
 Cultivo de células.

 Útil para el estudio de los procesos vitales celulares.


(secreción, estudio cromosómico y genético, etc.)

 El cultivo consiste en lograr la reproducción de células en


medios de cultivos apropiados.

 La observación de células cultivadas se hace de preferencia


con microscopio de contraste de fase y puede filmarse
(cinematográfica o microcinematografía).
TÉCNICAS ESPECIALES:
Micromanipulación y microcirugía

 Reducen la amplitud de los movimientos y permiten el


desplazamiento de microagujas, micropipetas y
microelectrodos en el campo microscópico
(microdisección, microcirugía )
TÉCNICAS ESPECIALES:
Micromanipulación y microcirugía

M. de micromanipulación Eliminación de zona pelucida


en ovocito
Centrifugación diferencial

 Separación de los diferentes componentes estructurales y


ultraestructurales de las células.

 Procedimiento:
 Homogeneización: fraccionamiento celular mediante un
ligero machacado
 Ruptura de membrana celular y liberación de contenido

 Centrifugaciones sucesivas a velocidades entre mil a 300


mil veces la fuerza de gravedad.

 Las fracciones celulares así obtenidas pueden someterse a


análisis bioquímicos y al examen con ME.
Centrifugación diferencial

Centrífugas
Centrifugación.Isopicnica Centrifugación Zonal
 Separa las partículas en  La muestra se deposita en la
gradiente de densidades. parte superior de la gradiente
 Utiliza solución con cloruro de densidades formada.
de cesio.  Utiliza gradiente de sacarosa
 Separa partículas similares en  Separa particulas en función
tamaño , pero diferente de la masa.
densidad.  Separa mitocondrias,
 Separa Ac. Nucleicos o lisosomas ,peroxisomas
diferentes organoides
celulares
TÉCNICAS ESPECIALES:
Citoquímica e Histoquímica
 Muestra “in situ” células y tejidos, la ubicación de los
diferentes componentes químicos.

 Métodos químicos y

 Métodos físicos
Métodos químicos
Son reacciones químicas específicas para detectar sustancias.

 Carbohidratos: Schiff PAS

 Colaración Sciff.PAS:

 El corte histológico, desparafinado e hidratado, es sometido a la


acción del ácido peryódico (oxidante enérgico) que convierte la
glucosa en aldehído sin color.

 Reactivo de Schiff (que es fucsina básica, decolorada con


bisulfito de sodio) que al reaccionar con los aldehídos produce
un color púrpura o magenta.
Métodos químicos
 Lípidos; Sudan III, IV, negro
(corte por congelación)

 Proteínas: R. Ninhidrina
-Generales
- De grupo ,
- Específicas.

 Enzimas
 Fijación inmediata a temperat.
inferiores a 0 º C y los cortes
generalmente se realizan en un
criostato congeladora.
 NADPdiaforasas sarcosomas Crióstato para cortes de histoquímica,
 Sal de tetrazolio (mitocondrias Inmunohistoquímica, imnufluorescencia,
azules)
Autorradiografía, patología, neurociencia,
etc.
Lípidos: Coloración con Sudán III
Métodos químicos
 Ácidos Nucleicos: Reacción de Feulgen para DNA

 Técnica:
Hidrólisis con ácido clorhídrico normal desprende las
purinas de la desoxirribosa quedando un grupo aldehído
libre que se colorea con el reactivo de Schiff- PAS.

 Minerales: Calcio ( Von Kossa) ,hierro (Pearls : azul de


Prusia) producen compuestos coloreados al unirse a
determinados reactivos.
Técnica de hibridación
Métodos físicos
 Microespectrofotometría
Utiliza un fotómetro adaptado al
microscopio que mide la luz absorbida por
una determinada sustancia coloreada (en
el caso del microscopio de campo claro) o
sin colorear (en el caso del microscopio de
luz ultravioleta) se puede determinar la
cantidad de dicha sustancia.
Métodos físicos: Historradiografía

 Se utilizan rayos X blandos (de la mayor longitud de onda)


los que, al atravesar un corte histológico, son absorbidos
por algunas sustancias minerales.

 Historradiografía de contacto: Se coloca el tejido sobre


una placa fotográfica y los rayos X que atraviesan la
muestra impresionan la emulsión fotográfica,
obteniéndose un historradiograma. Cuando el tejido se
coloca a cierta distancia de la placa fotográfica y el
historradiograma aparece ampliado se llama también
microscopio de rayos X.
Métodos físicos: Autorradiografía o
radioautografía

 Esta técnica estudia de las funciones de los organoides celulares, el


metabolismo y el destino final de ciertas sustancias; así como la
identificación de cromosomas y a. nucleicos.
 Se emplea isótopos radioactivos (tritio y carbono 14) como marcadores
de moléculas primordiales de las células (glucosa, aminoácidos, bases
nitrogenadas).
 Se administra las moléculas marcadas a un ser vivo o a un medio de
cultivo de células, en donde sufren combinaciones y recombinaciones.
 Se ubica los sitios de la molécula marcada mediante radiaciones beta
emitidas por el isótopo.
 Las radiaciones impresionan la película fotográfica colocada en el corte
histológico, se revela y se ubican los isótopos radioactivo al MO o en ME.
Inmunofluorescencia

Aislamiento del virus: Prueba de anticuerpos fluorescentes


Métodos físicos: Microincineración
 Sirve para apreciar la distribución de las sustancias
minerales en los tejidos
 Método:
 Las láminas con los cortes histológicos son introducidos en
un horno de diseño especial. (temperatura alrededor de 225 º
C), se queman las sustancias orgánicas quedando los residuos
o cenizas minerales en los sitios que ocupaban en el tejido
fresco.

 Observación de lámina con M. de campo oscuro o de luz


polarizada. La imagen de la distribución de las sustancias
minerales en las células o tejidos incinerados se llama
espodograma.
Inmunohistoquímica - Inmunofluorescencia

Crióstato para cortes de histoquímica,


Inmunohistoquímica, imnufluorescencia,
Autorradiografía, patología, neurociencia, etc.
 Se utiliza M. de
fluorescencia. La técnica
detecta los antígenos
celulares y los lugares de
producción de
anticuerpos que se
colorean con sustancias
fluorescentes.
Inmunohistoquímica - Inmunofluorescencia
Histoprocesamiento
Inmunohistoquímica - Inmunofluorescencia

Histoprocesamiento Histoinclusión
Inmunohistoquímica - Inmunofluorescencia

Realización de cortes Montaje de la tejidos en


histológicos en micrótomo lámina
Inmunohistoquímica - Inmunofluorescencia

Tinción con H.E e Histoquímica especial:


detecta la presencia de sustancias,
microorganismos, o naturaleza de Técnica de
determinados componentes del tejido Inmunohistoquimica:
estudiado (Van Gieson, Giemsa, Pas,
Rojo Congo, Kenyou, Gomori, etc.)
Difracción de rayos X
 Se utilizan los rayos X que,
al atravesar las mallas
moleculares, se difractan y
proyectan un espectro de
puntos y rayas. Este
espectro, al ser sometido al
análisis matemático, revela
la orientación de las
moléculas y la disposición
de sus átomos dentro de
ellas.
Difracción de rayos X
Otras técnicas de biología celular

Kits de transfección génica Bandeo de cromosomas


Coloración de cromosomas