Optimization of conditions to extract high

quality DNA for PCR analysis from whole

blood using SDS-Proteinase K method

Wajhul Qamara,b*, Mohammad Rashid Khana,b, Azher Arafahc*

a Pharmacogenetics Unit, Central Laboratory, Research Center, College of pharmacy, King Saud University, P.O. Box
2457, Riyadh 11451, Saudi Arabia
bDepartment of Pharmacology and Toxicology, Research Center, College of pharmacy, King Saud University, P.O. Box
2457, Riyadh 11451, Saudi Arabia
cDepartment of Clinical Pharmacy, College of pharmacy, King Saud University, Riyadh 11451, Saudi Arabia
INTRODUCCIÓN
• Extracción de ADN = Paso clave en estudios genéticos
• Sangre total principal fuente de ADN
• Etapas:
1. Lisis y eliminación de GR (RBC)
2. Lisis de GB (WBC) – eliminación de proteínas
3. Extracción y Lavado de ADN
• Cantidad, calidad e integridad DEPENDEN Reactivos y su cc
 Materiales y métodos
Sustancias químicas y Reactivos
SDS: Dodecilsulfato de sodio Muestras de sangre
EDTA: Etilendiaminotetracetico Muestras obtenidas del King Khalid University
Hospital; vacutainers heparinizados y se
Tris HCl
almacenaron a 2-8ºC. Las muestras recogidas se
Proteinasa K procesaron para extracción de ADN en 72 horas de
SYBR Green PCR Master Mix – Applied Biosystem colección
Cloruro de amonio
Etanol
Acetato de amonio
Bicarbonato de sodio
Cloruro de sodio
RNAse A
Métodos de extracción de ADN
• Lisis y eliminación GR
1. En un tubo de centrífuga de 15 ml se tomaron 2 ml de sangre
2. Se añadieron 8 ml de solución de lisis de RBC que contenía NH4Cl (cloruro de amonio) (150
mM), NaHCO3 (bicarbonato sódico) (10 mM) y EDTA disódico (0,1 mM).
3. Los tubos se colocaron en un tubo rotador durante 5 min. Todos los tubos se
centrifugaron durante 10 minutos a 300 X la fuerza de la gravedad.
4. El sobrenadante se descartó y el sedimento de células blancas se resuspendió en 500
μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía:
NaCl (cloruro sódico) (137 mM),
KCl (cloruro potásico) (2,7 mM),
Na2HPO4 (fosfato dibásico sódico) (10 mM) y
KH2PO4 (fosfato de potasio monobásico) (1,8 mM),
*el pH se ajustó a 7,4.
*Esta etapa de lisis y eliminación de RBC se repitió tres veces y, al final, se obtuvo un
sedimento blanco limpio exento de GR y se resuspendió en 500 μl de solución salina
tamponada con fosfato (PBS).
• Lisis GB
1. En suspensión de WBC se añadieron 1,5 ml de tampón de lisis (pH 8,0) que
contenía

tris-HCl (20 mM)

EDTA disódico (0,1 mM)
NaCl (25 mM)
500 μl de dodecilsulfato de sodio (SDS, 10%) y
50 μl de proteinasa K recién preparada (10 mg / ml de PBS).

2. Esta mezcla se incubó a 50 ° C en un baño de agua durante dos horas. Esta

incubación es un período mínimo para obtener una solución de células lisadas
claras.
Extracción y recolección de ADN
1. Se añadieron 500 μl de acetato de amonio 7,5 M en cada muestra
2. Se sometieron a agitación vorticial hasta que la solución fue homogénea.
3. En esta mezcla, que es aproximadamente 3 ml, se añadieron 7 ml de etanol absoluto helado y los
tubos de muestra se invirtieron hasta que se observó un sedimento de ADN condensado.
4. Este sedimento de ADN se recogió con la ayuda de una punta de pipeta de calibre ancho unida a una
micropipeta de 100 μl.
5. El sedimento de ADN se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se lavó con 500 μl, etanol al 70%.
6. El etanol se eliminó cuidadosamente usando una micropipeta y se dejó sedimento de ADN en el tubo
y se secó al aire a temperatura ambiente.
7. Después de secar el sedimento, se añadieron 100-200 μl de tampón trisEDTA (TE) (pH 8,0)
8. los tubos se incubaron a 37ºC para permitir que el sedimento de ADN formara una solución
transparente y homogénea.
9. Todas las muestras se almacenaron a -20ºC.
Determinación de la concentración y pureza del ADN
• La concentración y la pureza del ADN se midieron en un NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, EE.
UU.). Se controlaron las relaciones A260 / A280 y A260 / A230

Determinación de la integridad del ADN por qPCR

• La integridad del ADN extraído se determinó por amplificación por RT-PCR de CYP2C9 usando
Forward (5'-GCCTGAACCCATAGTGGTG-3’) y Reverse (5'- GGGGCTGCTCAAAATCTTGATG-3’).
• Step One Plus Real Time PCR.

• Brevemente, en una mezcla de reacción de 25 μl, 12.5 μl de SYBR Green Master Mix (2x), 1 μl
de ADN molde (que contiene 100-200 ng de ADN), 1 μl de cebador directo (5 pmol / μl), 1 μl de
cebador inverso (5 pmol / μl) y 9.5 μl H2O. Los pasos en el ciclo térmico incluyeron 60 ° C 30 s, 1
ciclo; 95 ° C 5 min, 1 ciclo; 95 ° C 15 s - 60 ° C 30 s - 72 ° C 30 s - 40 ciclos; 60 ° C 30 s, 1 ciclo post
PCR leído.
 RESULTADOS
Calidad del ADN, con método
optimizado:
• La relación A260 / A280 es un indicador
para el nivel de contaminación de
proteínas y para el ADN puro es de 1.8
La proporción promedio de A260 /
A280 fue 1.81 ± 0.05
• La relación A260 / A230, un indicador
de contaminación orgánica resultó ser
2.07 ± 0.07
• Para el ADN no contaminado se
informa que es 2-2.2.
Extracción de ADN con incubación a 55 ° C durante dos horas. y
baja concentración de proteinasa K (10 μl de 10 mg/ml).
Varias muestras de ADN extraídas de sangre completa sin lavado
de gránulos (etanol al 70%)
Integridad del ADN
Diagrama de amplificación para
el gen CYP2C9 muestra la
integridad de muestras de ADN
extraídas de sangre completa.
Se amplificaron 10 muestras de
ADN seleccionadas al azar, que
muestran ΔCt alrededor de 23.
Discusión
Efecto de enzimas sobre contaminación:
10 μl de la reserva de enzimas recientemente eliminada redujeron la cantidad de
proteínas, sin embargo, se encontró que era insuficiente para alcanzar la relación A260 /
A280
50 μl del mismo stock fueron capaces de eliminar todas las proteínas de manera eficiente y
se pudo alcanzar la relación A260 / A280 deseada de alrededor de 1,8.
Temperatura de incubación:
55 ° C parece afectar negativamente a las actividades de proteinasa K, lo que fue aparente
por la contaminación de proteínas en las muestras de ADN.
50 ° C, la proteinasa K del mismo stock digirió de manera eficiente todas las proteínas.
El tiempo de almacenamiento y los ciclos repetidos de congelación y descongelación de la
reserva de proteinasa K también afectaron la eficacia de la enzima.
Estas observaciones se reducen a seguir tres factores que juegan un papel importante en
este método en asociación con la actividad de proteinasa K.
(i) concentración de proteinasa K,
(ii) temperatura
(iii) condición de almacenamiento de la enzima.
Como se describe que la extracción de ADN en sangre completa se realiza en tres
pasos principales, la optimización no se puede completar sin la inclusión de todos
estos pasos.
1. La eliminación cuidadosa de los glóbulos rojos en el primer paso mediante tres
lavados con solución de lisis es crucial para garantizar la alta pureza del ADN.
2. De manera similar, la última etapa de lavado del sedimento de ADN con etanol
al 70% eliminó toda la sal contaminante del sedimento de ADN. En el presente
método, es eficaz en la eliminación de la contaminación por acetato de
amonio.
3. El secado con aire del gránulo a temperatura ambiente también es importante
para eliminar el etanol restante de la muestra.
4. Los pellets no se deben secar en exceso; puede causar algunas dificultades al
disolver los gránulos en tampón (buffer) TE.
CONCLUSIÓN
• Con el presente método, el objetivo de la relación A260 / A280 de 1.8
podría lograrse mediante la optimización junto con una relación A260
/ A230 significativamente mejorada.
• El presente método es rentable en comparación con los kits de
extracción de ADN comercial, sin embargo, el consumo de tiempo por
este método, en comparación con los kits, restringe el número de
muestras procesadas y puede recomendarse para los laboratorios que
trabajan con menos muestras.
• El método propuesto también se puede usar para extraer ADN de
sangre fresca de roedores, conejos, pájaros, etc.
Gracias