Expresión de La Lignina Peroxidasa H2 de Phanerochaete Chrysosporium Por La Cepa Pichia Recombinante de Múltiples Copias

EXPRESIÓN DE LA LIGNINA PEROXIDASA H2
DE PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM POR

LA CEPA PICHIA RECOMBINANTE DE MÚLTIPLES COPIAS.
Qco. LUIS CARLOS DE LA TORRE C.

Qf. XXXXXX XXXXXX XXXXXXX.
Bio. XXXXXX XXXXXX XXXXXX.
MSc(e). BIOTECNOLOGÍA
UNIVERSIDAD LIBRE
BARRANQUILLA COLOMBIA
2018
INTRODUCCIÓN
"COMBUSTIÓN ENZIMÁTICA" DE LA LIGNINA.
La lignina, es el polímero aromático más abundante en la tierra (con una masa total de
aproximadamente 160 gigatoneladas) y el segundo compuesto, detrás de la celulosa, en contribuir a la
biomasa terrestre (Schimmel et al., 1994).
Sus funciones biológicas, dar rigidez a las plantas vasculares y proteger sus polisacáridos estructurales
(celulosa y hemicelulosa) del ataque microbiano, son consistentes con el hecho de que la lignina es
probablemente el compuesto orgánico natural más recalcitrante a la biodegradación (Hammel, 1997).
Una vez que los árboles y otras plantas leñosas mueren y su biomasa se incorpora al suelo, este material
recalcitrante debe ser biodegradado y reciclado por los microorganismos para mantener el ciclo natural
del carbono.
Los principales organismos responsables de la degradación de los materiales lignocelulósicos son hongos
filamentosos, y entre ellos los degradadores más eficaces son los basidiomicetos (Crawford, 1981;
Eriksson et al., 1990). De todos los basidiomicetos, los más interesantes son los llamados de
podredumbre blanca, por su capacidad para degradar extensamente la lignina (Kirk y Farrell, 1987).
• Burdsall, H.H. Jr.; Eslyn, W.E. 1974. A new Phanerochaete with a Chrysosporium imperfect state. Mycotaxon. 1(2):123-133.
• Martinez D et al., "Secuencia del genoma del hongo degradante de lignocelulosa Phanerochaete chrysosporium cepa RP78", Nat Biotechnol, 2004 Jun; 22 (6): 695-
700.
INTRODUCCIÓN
"COMBUSTIÓN ENZIMÁTICA" DE LA LIGNINA.
Su estrategia se basa en degradar este polímero para poder

acceder a la celulosa y hemicelulosa que se encuentran incrustadas
en la matriz de lignina. De esta forma, los materiales
lignocelulósicos son transformados en un material blanco
enriquecido en celulosa, de ahí el nombre de podredumbre blanca
(Zabel y Morrell, 1992). Dentro del grupo de basidiomicetos
capaces de degradar sustratos lignocelulósicos, el hongo más
estudiado es Phanerochaete chrysosporium. Kirk et al. (1978)
700.
INTRODUCCIÓN
SISTEMA LIGNINOLÍTICO DE LOS HONGOS DE
PODREDUMBRE BLANCA
La naturaleza recalcitrante y heterogénea de la lignina da lugar a
que los hongos de podredumbre blanca deban emplear métodos
inusuales de biodegradación capaces de hacer frente a varios
problemas (Hammel, 1997).
Por un lado, el gran tamaño del polímero y su elevado número de

ramificaciones que forman una trama tridimensional implica que
los mecanismos de degradación deben ser extracelulares. El
proceso es oxidativo y, como ya se ha mencionado, la primera
reacción clave identificada en la degradación de la lignina por P.
chrysosporium fue la oxidación por H2O2 (Faison y Kirk, 1983).
700.
INTRODUCCIÓN
PEROXIDASAS LIGNINOLÍTICAS.
El descubrimiento simultáneo por parte de Tien y Kirk (1983) y

Glenn et al. (1983) de la primera “ligninasa”, en cultivos de P.
chrysosporium, supuso el hallazgo más trascendente en relación
con los estudios sobre la biodegradación de la lignina.
Esta enzima, denominada lignina peroxidasa (LiP), oxida

compuestos aromáticos de alto potencial redox, como el alcohol
veratrílico (VA), metoxibencenos, y dímeros modelo de lignina no
fenólicos por un mecanismo común que implica la formación de
radicales catiónicos aromáticos (Hammel et al., 1985; Kersten et
al., 1985).
700.
INTRODUCCIÓN
LACASAS.
La mayoría de los hongos de podredumbre blanca secretan una o

varias lacasas, siendo ésta una característica utilizada para su
identificación (Käärik, 1965; Nobles, 1965; Stalpers, 1978). Las
lacasas son metaloenzimas con cobre que catalizan la oxidación
de un gran número de compuestos fenólicos y aminas
aromáticas, utilizando O2 como aceptor final de electrones
(produciendo H2O) (Thurston, 1994; Mayer y Staples, 2002).
700.
INTRODUCCIÓN
OXIDASAS PRODUCTORAS DE H2O2
Las oxidasas constituyen una fuente enzimática del H2O2

requerido por las peroxidasas ligninolíticas. En un principio se
sugirió que el H2O2 empleado por las peroxidasas de P.
chrysosporium procedía de oxidasas intracelulares, como la
glucosa oxidasa (Kelley y Reddy, 1986) o la metanol oxidasa
(Nishida y Eriksson, 1987). Sin embargo, estas enzimas
requerirían un sistema de transporte del H2O2 al medio
extracelular, que minimizase el daño intracelular.
700.
INTRODUCCIÓN
METABOLITOS DE BAJO PESO MOLECULAR
ligninolíticos que han sido estudiados en relación con la degradación de la lignina. Antes incluso del
descubrimiento de la LiP, Shimada et al. (1981) observaron que P. chrysosporium sintetizaba VA de forma
paralela a la aparición de la actividad ligninolítica, observándose posteriormente que este metabolito tenía
un efecto positivo sobre la producción de LiP (Faison et al.,1986).
El VA favorece la oxidación de compuestos aromáticos no fenólicos, como el alcohol p-anisílico (4-

metoxibencílico), fenoles y colorantes de tipo azo por la LiP, aunque por mecanismos distintos. En el caso
del alcohol panisílico, se ha demostrado que el VA resulta necesario para cerrar el ciclo catalítico de la
enzima (Koduri y Tien, 1994).
Por el contrario, en la oxidación de compuestos fenólicos (Harvey y Palmer, 1990; Chung y Aust, 1995;
Koduri y Tien, 1995) y colorantes de tipo azo (Paszczynski y Crawford, 1991) que inhiben la LiP en
ausencia de VA, el radical catiónico del VA actúa como mediador redox, y lo mismo se ha propuesto para
la oxidación de algunos sustratos aromáticos no fenólicos (Tien y Ma, 1997).
700.
INTRODUCCIÓN
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS
La capacidad que presentan los hongos de podredumbre blanca para degradar el polímero de lignina los
ha convertido en herramientas potenciales en distintas fases de la fabricación de papel (Martínez et al.,
1992; Bajpai y Bajpai, 1998), que supone el más importante uso industrial no alimenticio de la biomasa
vegetal en el mundo.
La obtención de la pasta de celulosa con la que se fabrican las hojas de papel implica básicamente el
aislamiento de la fibras celulósicas que constituyen la mayor parte de la estructura de la madera, por
medios químicos o mecánicos, hasta obtener una suspensión acuosa (pasta de papel). Puesto que la
lignina actúa como una especie de cemento entre las fibras, su eliminación es un paso clave en este
proceso. Además, los compuestos derivados de la lignina son los responsables del color de la pasta
obtenida químicamente, que debe ser eliminado antes de fabricar el papel.
El tratamiento de la madera con hongos capaces de degradar la lignina en un paso previo a la fabricación
de la pasta (en procesos de “biopasteo”) podría reducir el gasto energético en este proceso, al eliminarse
parcialmente el "cemento" entre las fibras.
700.
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
ORGANISMOS Y VECTORES
Origen y mantenimiento de las cepas utilizadas.
Para la realización de este trabajo se han utilizado una cepas de hongo:

P. chrysosporium BKM-F-1767 (ATCC no. 24725): se cultivó de forma similar a la de Li et al. (1994),
con dextrina como fuente de carbono.
Cepas de E. coli
DH5α (Hanahan, 1983): La cepa bacteriana se cultivo a 37ºC en placas con medio LB sólido, con
resiembras periódicas conservadas a 4ºC. Para su conservación de forma indefinida a -80ºC, se añadió
glicerol al 20% a cultivos que habían crecido en medio LB líquido (Sambrook y Russell, 2001).
Asimismo se empleó una cepa de levadura.

Pichia pastoris X-33, una cepa de Pichia silvestre adquirida de Invitrogen, EE.UU., utilizada para la
expresión de LiP, se cultivó en YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de dextrosa).
700.
Vector pUCm-T (Takara, Japón) es ideal para clonar

productos de PCR del extremo A terminal. Los clones
recombinantes con insertos se pueden cribar con
manchas azules y blancas. Muchas ADN polimerasas
añaden una base A prominente al extremo 3 'de cada
cadena del ADN bicatenario del producto de PCR
durante la amplificación por PCR.
LA INFORMACIÓN PRINCIPAL DEL VECTOR PUCM-T ES LA SIGUIENTE:

Pares de bases 2773
Promotor de Lac Z 142-171
M13 / pUC Sequencing Primer 204-221
Lac Z 222-534
Región de clonación múltiple 233-376
M13 / pUC Reverse Primer 378-395
Región de codificación de Beta-lactamasa sintética (Ampr) 972-1832
Origen de replicación ColE1 (rep) 1987-2606
700.
Vector pPICZαA (Invitrogen, EE. UU.) Los vectores

pPICα A, B y C son vectores de 3,6 kb usados para
expresar y secretar proteínas recombinantes en Pichia
pastoris.
 Contiene el promotor AOX1 para la expresión del gen de interés

fuertemente regulada, inducida por metanol.
 Se proporcionan los tres marcos de lectura (versiones A, B, C)
para facilitar la clonación con C-terminal péptido.
 Señal de secreción del factor α para dirigir la expresión
secretada de la proteína recombinante.
 Gen de resistencia a zeocina para selección en E. coli y Pichia.
 Péptido C-terminal que contiene el epítopo c-myc y una etiqueta
de polihistidina (6xHis) para la detección y purificación de una
proteína de fusión recombinante.
700.
CLONACIÓN DE GENES Y CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR DE EXPRESIÓN.
Phanerochaete chrysosporium: Crecido en medio YPG y con dextrina como

fuente de carbono. Se incubaron durante 8 días.
Se Recogieron los micelios (X mg)
1. 1 ml TRIzol®,
2. Homogenizar 5 min 12000 g (4-10 °C)
3. Incubar durante 5 min
4. Agregar 0,2 mL de cloroformo
5. Incubar durante (2-3) min
6. Centrifugar 15 min a 12000 g (4 °C)
La parte Acuosa superior transparente (Contiene ARN), las capas interfásicas
(Contienen el ADN) y las capas rojas orgánicas inferiores (Contienen las
proteínas).
700.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).
ARN total como molde (Phanerochaete chrysosporium)
1 CGGAATTCCCGAACCTCGACAAGCGACGT-------------CACGAGATCTCAACCCCCTGCCGCC
2 GCCTTAAGGGCTTGGAGCTGTTCGCTGCA------------GTGCTCTAGAGTTGGGGGACGGCGG
CEBADOR 2
GCTCTAGAGTTGGGGGACGGCGG
--CGGAATTCCCGAACCTCGACAAGCGACGT-------------CACGAGATCTCAACCCCCTGCCGCC
CEBADOR 1
CGGAATTCCCGAACCTCGACAAGCG
GCCTTAAGGGCTTGGAGCTGTTCGCTGCA------------GTGCTCTAGAGTTGGGGGACGGCGG----
Los cebadores se diseñaron con sitios de restricción EcoRI y XbaI insertados (subrayados) que permiten
la clonación direccional del ADN amplificado en el marco con la secuencia líder del factor α en el vector de
expresión pPICZαA.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).
La amplificación se llevó a cabo en las siguientes condiciones:
La amplificación se llevó a cabo en las

siguientes condiciones: el primer paso
fue a 95 ° C durante 1 minuto, seguido
de 30 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 52 °
C durante 1 minuto y 72 ° C durante 2
minutos, y la extensión final se llevó a
cabo a 72 ° C durante 10 min. La
secuencia de corrección del fragmento
amplificado se confirmó por
secuenciación de ADN.
El fragmento amplificado con sitios de

restricción EcoRI y XbaI insertados
(subrayados) que permiten la clonación
direccional.
REACCIÓN CLONACIÓN.
Clonación con vector pUCmT:
---CGGAATTCCCGAACCTCGACAAGCGACGT-------------CACGAGATCTCAACCCCCTGCCGCC
Sitio de corte
Sitio de corte
GCCTTAAGGGCTTGGAGCTGTTCGCTGCA------------GTGCTCTAGAGTTGGGGGACGGCGG------
XbaI
EcoRI
Extremos cohesivos
Extremos cohesivos
Clonación con vector pUCm-T-lipH2 :
Extremos cohesivos (b)
Extremos cohesivos (a)
ADN Ligasa
Vector de clonación digerido con

EcoRI y XbaI
Vector recombínate pUCmT-lipH2:
El fragmento amplificado se subclonó primero en el vector pUCm-T y dio como resultado el

vector recombinante pUCm-T-lipH2. El pUCm-TlipH2 se digirió con EcoRI y XbaI para
generar un fragmento de 1050 pb que se introdujo posteriormente en el vector de
expresión pPICZαA usando sitios EcoRI y XbaI.
MATERIALES Y MÉTODOS pUCm-T-lipH2
Vector recombínate pPICZαA-lipH2 :
XbaI EcoRI
fragmento de 1050 pb
pPICZαA
El pUCm-TlipH2 se digirió con EcoRI y XbaI para

generar un fragmento de 1050 pb que se
introdujo posteriormente en el vector de expresión
pPICZαA usando sitios EcoRI y XbaI.
pPICZαA-lipH2
MATERIALES Y MÉTODOS DH5α
Vector recombínate pPICZαA-lipH2 :
La inserción se verificó por análisis de restricción y

Agar LB que contenía
secuenciación de ADN. 25 μg/ml de zeocina.
pPICZαA-lipH2
Transformación de P. pastoris:
pPICZαA-lipH2
pPICZαA-lipH2
P. pastoris X-33
P. pastoris X-33
Selección de colonias recombinantes :
P. pastoris que contienen ADN ADN de LiPH2

LiPH2 se seleccionaron sobre la pPICZαA-lipH2
base de resistencia a zeocina.
Electroporación de impulso
P. pastoris X-33
100 μg/ml de zeocina 500 μg/ml de zeocina 1000 μg/ml de zeocina
YPDS (1% de extracto de levadura “X-33”, 2% de peptona, 2% dextrosa, 1 mol /L de sorbitol)

Selección de colonias recombinantes:
Colonias resistentes a zeocina

pPICZαA-lipH2
(MM) (MD)
Replicación
1,34% de base de nitrógeno de levadura, 1,34% de base de nitrógeno de levadura,

0,5% de metanol, (4x10-5)% de biotina. 2 % dextrosa, (4x10-5)% de biotina.
Selección de colonias recombinantes :
Crecieron
Fenotipos que Se seleccionaron todo los
Fenotipos Mut+ Normalmente
utilizan metanol transformantes Mut+
(MM) y (MD)
3-4 d de incubación “Los Mut- fenotipos crecieron muy
lentamente en las placas de MM”.
Se hacen crecer en 20 ml de medio complejo de

glicerol tamponado (BMGY). a 30 °C y 250 r/ min.
La inserción se
cebadores universales utilizados comprobó mediante
PCR
5'AOX1
(secuencia: 5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3') Analizado por secuenciación
de ADN
3'AOX1
(secuencias: 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3')
Generación de recombinantes multicopia:
Pichia pastoris es capaz de integrar múltiples copias de ADN transformante mediante recombinación en el
genoma en sitios de homología de secuencia. La cepa de Pichia recombinante que se había confirmado con la
integración de lipH2 se usó como receptor en este experimento de transformación para generar los
recombinantes de múltiples copias.
Colonias recombinantes Placas en YPDS (Zeocina)
Electroporación de Pichia
múltiples.
Selección
1000 μg/ml de Zeocina
verificación Controles
100, 200, 400 y 800 μg/ml de Zeocina

Producción de LiPH2 recombinante:
El cultivo del transformante de P. pastoris incluyó dos fases: una fase de crecimiento en glicerol y una fase de
inducción en metanol.
(extracto de levadura al 1%,
peptona al 2%, fosfato de Se Incubó a 30ºC y 250 r/min
Primera fase potasio 100 mmol/L, pH 6,0, durante aproximadamente 18 h.
Cepas de P.
pastoris Mut +
YNB al 1,34%, (4×10-5) % de
biotina, 1% de glicerol)
Medio complejo en
matraces de 250 ml
tamponado 50 mL
(Glicerol)
(1% de extracto de levadura,

Cultivo de 50 Recolectaron 2% de peptona, 100 mmol/L
ml (Glicerol) células
Segunda fase fosfato de potasio, pH 6,0,
recombinantes
1,34% de YNB, (4x10 - 5)% de
biotina, 0,5% de metanol)
Medio complejo en Se incubó a 30ºC, 250 r/min

matraces de 250 ml
Se Centrifugó a 3000 × tamponado 30 mL Durante la fase de inducción, se añadió
g durante 5 min (Metanol)
Etanol al 100% (V/V) continuamente para
La cepa Mut+ que porta solo el vector integrado pPICZαA sin inserción del gen lipH2 se usó como control. mantener su concentración en 0,5%.
Producción de LiPH2 recombinante:
Sobrenadante sin células se sometió a

análisis adicional.
Cultivo de levadura
(fase final)
Se Centrifugó
10000 x g durante Precipitado, Se evaluaron por electroforesis en gel
1 minuto dodecilsulfato de sodio-PAGE (SDSPAGE).
Se evaluaron los pesos moleculares de las proteínas

expresadas.
Las proteínas se visualizaron después de teñir con
Coomassie Brilliant Blue R-250 (0,1%).
La actividad de la lignina peroxidasa se determinó de
Los geles de apilamiento y separación contenían
acuerdo con el método de Tien y Kirk (1988). 5% y 12% de poliacrilamida, respectivamente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Clonación y análisis de secuencia de P. chrysosporium lignina peroxidasa isozima gen lipH2 :
Los resultados de la secuenciación mostraron que el fragmento amplificado, ADNc de LiPH2, que es exactamente
el mismo que el descrito previamente (de Boer, 1987), codifica una proteína con 350 aminoácidos y no contiene
el péptido señal putativo de 21-aa. El vector pUCm-T-lipH2 se muestra en la Figura 1.
Figura 1. Vector construido para la clonación del ADNc de

LiPH2 en E. coli, así como escisión por EcoRI y XbaI.
Construcción del vector para la expresión de LiP en P. pastoris y selección de colonias recombinantes:
El plásmido pPICZαA-lipH2 tiene un promotor inducible

AOX1, la señal de secreción del factor α de S. cerevisiae
en la región cadena arriba de la secuencia del ADNc de
LiPH2 (figura 2), y una señal de transcripción de
terminación. En el primer experimento de transformación,
solo se obtuvieron cuatro recombinantes, concretamente
X-33A, X-33B, X-33C y X-33D, a partir de las placas de
selección de YPDS que contenían 100 μg/ml de zeocina.
Todos confirmaron la integración en el locus AOX1 de la
secuencia que codifica LiPH2 por PCR (Fig. 3). No se
generaron recombinantes en las placas YPDS que
contenían 500 o 1000 μg / ml de zeocina.
Fig. 2 Plásmidos construidos para la expresión de lignina peroxidasa en P. pastoris. El

ADNc de LiPH2 se clonó en pPICZαA cadena abajo de la señal de secreción de α-actor de S.
cerevisiae nativa. La etiqueta de epítopo myc C-terminal permite la detección de la
proteína de fusión por el anticuerpo anti-myc o el anticuerpo anti-myc-HRP; la etiqueta de
polihistidina C-terminal permite la purificación de la proteína de fusión recombinante en la
resina quelante de metales; 5'AOX1 y AOX1 TT son el promotor y la región de terminación
de la transcripción del gen de la alcohol oxidasa de P. pastoris, respectivamente; TEF1 es el
promotor, particularmente el promotor del gen del factor de elongación de la transcripción
1 de Saccharomyces cerevisiae que impulsa la expresión del gen de resistencia a zeocina;
EM7 es el promotor constitutivo que impulsa la expresión del gen de resistencia Zeocina;
Zeocina es el gen de resistencia a zeocina y pUC ori permite la replicación y el
mantenimiento del plásmido en E. coli.
Todos confirmaron la integración en el locus AOX1 de la

secuencia que codifica LiPH2 por PCR (Fig. 3). No se
generaron recombinantes en las placas YPDS que contenían
500 o 1000 μg / ml de zeocina.
Fig. 3 Electroforesis en gel de agarosa de productos de PCR a partir de ADN

genómico de clones recombinantes de Pichia pastoris usando los cebadores 5'AOX1 /
3'AOX1. Carriles 1-4: clones recombinantes (X-33A, X-33B, X-33C y X-33D); carril
5: marcadores de peso molecular. Para los integrantes de Mut +, habrá dos bandas.
Uno corresponderá al tamaño del gen del labio, el otro al gen AOX1
(aproximadamente 2200 bp). Los plásmidos originales producirán los siguientes
productos de PCR de tamaño. Agregar el tamaño de estos productos al tamaño de
LiP para dar como resultado aproximadamente 1600 pb.
Se utilizo el recombinante (X-33A) como receptor en los experimentos de transformación para la

generación de recombinantes de múltiples copias. Un gran número de recombinantes creció en las placas
YPDS que contenían 100, 200, 400 y 800 μg/ml de zeocina, mientras que se obtuvieron
aproximadamente 50-100 transformantes de las placas YPDS que contenían 1000 μg/ml de zeocina.
Expresión de lipH2 en P. pastoris:
La actividad de la peroxidasa de la lignina se detectó en

el sobrenadante de los recombinantes de múltiples
copias cultivadas en medio complejo de metanol
tamponado en cultivo agitado, lo que indica que el LiPH2
se secretó por las células de levadura de múltiples
copias. La actividad de la lignina peroxidasa alcanzó un
máximo de 15 U/ L después de 12 h (Fig. 4). Sin
embargo, la actividad de la lignina peroxidasa no se
encontró en el sobrenadante del medio de cultivo de
copia baja o de una sola copia (el medio de cultivo de las
cepas X-33A, X-33B, X-33C y X-33D).
Fig. 4 Expresión de peroxidasa de lignina en P. pastoris según

el control X-33 (recombinante construida sin inserción del gen
de la peroxidasa de lignina), X-33A (recombinante construido
con inserción del gen de la peroxidasa de lignina) y X-33mA
(recombinante construido con múltiples copias cepas de lignina
peroxidasa).
Expresión de lipH2 en P. pastoris:
Para recombinantes de múltiples copias, concretamente X-

33mA y X-33mB, se observaron bandas distintas
correspondientes a aproximadamente 41 kDa en SDS-PAGE
desnaturalizante después de 24 h de incubación (Fig. 5),
mientras que no había banda en SDS-PAGE
desnaturalizante para cepa X-33A recombinante de baja
copia o copia única y cepa de control (control X-33).
Fig. 5 Análisis SDS-PAGE de proteínas secretadas por P. pastoris.

Carril 1: marcadores de bajo peso molecular; carril 2: X-33mA
(recombinante construido con multi-copia de pPICZαA-lipH2); carril
3: X-33mB (otro recombinante construido con multi-copia de
pPICZαA-lipH2); carril 4: X-33A (recombinante construido con
pPICZαA-lipH2); carril 5: control X-33 (recombinante construido con
pPICZαA).
CONCLUSIONES
En el estudio, se expresó LiPH2 usando el sistema de expresión de P. pastoris.
Los resultados de la PCR y del análisis de la secuencia indican que el gen de la lignina peroxidasa de P.
chrysosporium se clonó con éxito en P. pastoris.
La actividad de la lignina peroxidasa también se presentó mediante recombinantes de múltiples copias.

Además, la actividad de la lignina peroxidasa se detectó continuamente en el cultivo durante 84 h.
La peroxidasa de lignina no se detectó en el cultivo de recombinante de copia baja o de copia única. Los
resultados indican que el recombinante de múltiples copias es más eficiente en la producción de lignina
peroxidasa.
GRACIAS
LIGNINA
Estructura química de la lignina. Modelo para la lignina

de coníferas formada por polimerización
deshidrogenativa del alcohol coniferílico en el que se
muestran unidades guayacilpropano formando diferentes
tipos de subestructuras: 1) éter guayacilglicerol-β-arílico;
2) fenilcumarano; 3) pinorresinol; 4) éter difenílico; y 5)
dibenzodioxocina. La estructura 1 es la más frecuente, ya
que un 50- 60% de las unidades de la lignina están
unidas por enlaces β-O-4 (Adler, 1977). Mientras que 1-4
son estructuras diméricas, la estructura 5, recientemente
descrita (Karhunen et al., 1995), es una estructura
trimérica en la que los grupos OH de un bifenilo fenólico
forman dos enlaces éter conlos OH de los carbonos α y β
de la cadena lateral de una tercera unidad.
• E. Sjöström (1993). Wood Chemistry: Fundamentals and Applications. Academic Press. ISBN 0-12-647480-X.
• Taiz, Lincoln; Zeiger, Eduardo (2006). Fisiología vegetal 1. Universitat Jaume I. p. 549. ISBN 9788480216012. Consultado el 24 de mayo de 2012.
CCAGTCAGCCGAACCGGACATGGCCTTCAAGCAGCTCTTCGCCGCGATCACCGTCGCCCTCTCGCTCAC
CGCTGCCAACGCGGCCGTGGTCAAGGAGAAGCGCGCCACCTGCGCCAACGGCAAGACCGTCGGCGACGCG
TCCTGCTGCGCCTGGTTCGATGTCCTCGACGACATCCAGGCAAACATGTTCCATGGCGGCCAGTGCGGCG
CCGAGGCGCACGAGTCGATCCGTCTCGTCTTCCACGACTCCATCGCCATCTCGCCCGCCATGGAGGCCAA
GGGCAAGTTCGGCGGCGGCGGTGCCGACGGCTCGATCATGATCTTCGATACTATCGAGACTGCATTCCAC
CCCAACATCGGTCTCGACGAGGTCGTCGCGATGCAGAAGCCGTTCGTCCAGAAGCACGGTGTCACTCCCG
GAGACTTCATCGCCTTCGCCGGTGCTGTCGCGCTCAGCAACTGCCCGGGTGCTCCGCAGATGAACTTCTT
CACCGGCCGCAAGCCCGCTACCCAGCCTGCTCCGGACGGTCTCGTCCCCGAGCCCTTCCACACCGTCGAC
CAGATCATCGCCCGCGTGAACGACGCCGGTGAGTTCGATGAGCTCGAGCTCGTCTGGATGCTTTCTGCCC
ACTCCGTTGCTGCAGTCAACGATGTGGACCCGACCGTCCAGGGCCTGCCCTTCGACTCCACCCCCGGAAT
CTTCGACTCGCAGTTCTTCGTCGAGACTCAGTTCCGTGGCACTCTCTTCCCCGGCTCCGGTGGCAACCAG
GGTGAGGTCGAGTCCGGTATGGCCGGCGAGATCCGCATCCAGACCGACCACACTCTCGCCCGCGACTCCC
GCACCGCTTGCGAGTGGCAGTCGTTCGTCAACAACCAGTCCAAGCTCGTCGACGACTTCCAGTTCATCTT
CCTCGCCCTCACTCAACTCGGCCAGGACCCGAACGCGATGACCGACTGCTCCGACGTCATCCCCCTCTCG
AAGCCCATCCCCGGCAACGGCCCCTTCTCCTTCTTCCCGCCCGGCAAGTCCCACAGCGACATCGAGCAGG
CTTGCGCCGAGACCCCCTTCCCCAGCCTCGTCACCCTCCCCGGCCCCGCCACCTCGGTCGCTCGCATCCC
CCCGCACAAGGCCTAAATTCTTGCAGAATCGGCTGCGATGTTAACGGTTATCCTACTCAACGGTCCATTC
GTCACGGAATATCGGTCTCTGTACTAGAAGTGTTCCTCTCGTGTATCCCAGTGTATTGTTTGCATCCCGT
GTCCAAGAATCAATCCGGATTGTATTCACCTAAA

Expresión de La Lignina Peroxidasa H2 de Phanerochaete Chrysosporium Por La Cepa Pichia Recombinante de Múltiples Copias

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EXPRESIÓN DE LA LIGNINA PEROXIDASA H2

DE PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM POR

Qco. LUIS CARLOS DE LA TORRE C.

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Colonias resistentes a zeocina

1,34% de base de nitrógeno de levadura, 1,34% de base de nitrógeno de levadura,

Se hacen crecer en 20 ml de medio complejo de

100, 200, 400 y 800 μg/ml de Zeocina

(1% de extracto de levadura,

Medio complejo en Se incubó a 30ºC, 250 r/min

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