Análisis microbiológico de

vinos y mostos
O.I.V.
Lic. René Alberto Juez
2010
 Análisis microbiológico de vinos y
mostos
• Objetivo:
• Seguir las fermentaciones alcohólica y/o
maloláctica
• Revelar los riesgos de alteraciones
microbianas, que permitan detectar toda
anomalía durante las etapas de
fabricación y en el producto terminado
 Análisis microbiológico de vinos y
mostos

• El análisis microbiológico puede ser

aplicado al VINO, al MOSTO, a los
MISTELAS y a todos esos aún cuando
estén alterados por una actividad
microbiana
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mostos
• IMPORTANTE RECORDAR:
• TODAS LAS MANIPULACIONES con
técnicas asépticas
• Utilizar material esterilizado
• Trabajar en las cercanías de la llama del
mechero o en cámara de flujo laminar
• Quemar los orificios de las pipetas, tubos,
frascos, etc.
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mostos
• ETAPAS:

• 1) TOMA DE MUESTRA

• 2) ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
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mostos
• Técnicas de Extracción de la Muestra:
• Las muestras deben ser
REPRESENTATIVAS
• Se utilizan:
- pipetas para lo toneles
- tubos largos de vidrio para las cubas
• Las extracciones se deben hacer en
lugares previamente esterilizados
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mostos
• Técnicas de Extracción de la Muestra:
• Extracciones del grifo de degustador de
las cubas:
- Dejar correr algunos litros de muestra
- Desinfectar las superficies de contacto
(alcohol 70% o quemador a gas)
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mostos
• Importante:
• Transporte y almacenamiento de las
muestras: en frío (4 a 5 °C). El menor
tiempo posible
• Si es necesario estabilizar la carga
microbiana
• Los análisis deben hacerse lo más
rápidamente posible luego de la
extracción de la muestra
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mostos
• Técnicas de Análisis Microbiológico: se
aplican según la información que se desee
obtener

• Ensayos de comportamiento:
- Ensayo de comportamiento al aire
- Ensayo de comportamiento en estufa
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• Detección, Diferenciación de
Microorganismos y Recuento Directo de
Levaduras:
- Examen microscópico de los líquidos o de
los depósitos
- Coloración vital con azul de metileno
- Coloración de Gram
- Determinación de catalasa
- Recuento directo de las levaduras en
microscopio
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mostos
• Recuento de los microorganismos por
cultivo:
- Cultivo en y sobre medio o soporte sólido:
* Cultivo en placas
* Cultivo en membrana luego de
filtración
- Cultivo en medio líquido. Cantidad más
probable (CMP)
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mostos
• Ensayos de comportamiento:
• Objetivo: revelar anticipadamente los riesgos
de alteraciones microbianas
• Principio: se basa en las modificaciones
organolépticas presentadas por el vino
cuando es sometido a ciertas condiciones de
aireación o de temperatura, que pueden
traducir una actividad microbiana
Confirmación Microscópica
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• Ensayos de comportamiento:
• Procedimiento:
- Ensayo de comportamiento al aire
1) Muestra: 50 ml de vino
2) Filtración por papel grueso estéril
3) Colocar en un erlenmeyer estéril de 150 ml,
tapado con algodón y dejarlo a temperatura
ambiente - 3 días
4) Examinar organolépticamente durante los
3 días
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• Ensayos de comportamiento:
• Procedimiento:
- Ensayo de comportamiento en estufa
1) Muestra: 100 ml de vino
2) Filtración por papel grueso estéril
3) Colocar en un erlenmeyer estéril de 150 ml,
tapado con algodón y colocarlo en estufa a 30
°C - 72 horas
4) Examinar organolépticamente durante las
72 horas
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• Detección , Diferenciación de
Microorganismos y Rcto Directo de Levaduras:
- Examen microscópico de los líquidos o de los
depósitos
• Objetivo: revelar y diferenciar las levaduras
de las bacterias eventualmente presentes ( NO
distingue vivos de muertos)
• Principio: se basa en la amplificación de la
imagen que realiza el microscopio,
permitiendo ver seres tan pequeños
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• - Examen microscópico de los líquidos o de los
depósitos
• Procedimiento: se puede realizar
directamente en el líquido cuando la
población es suficientemente elevada o en el
depósito cuando es inferior Concentrar:
centrifugar 10 ml de vino a 3000 - 5000 rpm
durante 5 a 15 minutos y descartar el
sobrenadante
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• - Examen microscópico de los líquidos o de los
depósitos
• - Realizar un examen en fresco (una gota
entre porta y cubre) en campo claro o en
contraste de fase. Aumento: 400 - 1000
diámetros
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• Detección , Diferenciación de
Microorganismos y Rcto Directo de Levaduras:
- Coloración vital con azul de metileno
• Objetivo: permite diferenciar las levaduras
vivas de las muertas
• Principio: se basa en la presencia de enzimas
en las células vivas, que reducen el colorante
• Células vivas se reduce en leucoderivado
incoloro.
• Células muertas azules
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• - Coloración vital con azul de metileno
• Reactivo: solución de azul de metileno al 0,1
% (solución fresca)
• Procedimiento: colocar una gota de muestra y
una de colorante, mezclar y dejar reposar 5
minutos. Observar en el microscopio en
campo claro
• Esta técnica se utiliza para recuentos
aproximados y no se recomienda para
bacterias
Observación microscópica de
levaduras
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• Detección , Diferenciación de
Microorganismos y Rcto Directo de Levaduras:
- Coloración de Gram
• Objetivo: permite diferenciar las bacterias
lácticas (Gram +) de las bacterias acéticas
(Gram -) y observar su morfología (pero
pueden no ser las únicas)
• Principio: diferencia en la estructura y la
composición química de la pared celular
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• - Coloración de Gram
• Soluciones: violeta de genciana, lugol,
decolorante y safranina o fucsina
• Procedimiento:
- violeta de genciana 2 min.
- lugol 30 seg.
- decolorante 15 seg. (según el espesor del
preparado)
- safranina o fucsina 10 seg.
- Lavar con agua del grifo entre cada paso
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• - Coloración de Gram
• Observación: colocar una gota de aceite de
inmersión y observar con objetivo de
inmersión
• Resultados: las bacterias lácticas permanecen
violeta o azul oscuro (Gram +) y las bacterias
acéticas de color rojo o fucsia (Gram -)
Bacterias lácticas
Bacterias acéticas
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• Detección , Diferenciación de
Microorganismos y Rcto Directo de Levaduras:
- Determinación de la catalasa
• Objetivo: distinguir entre bacterias acéticas
(reacción + al igual que las levaduras) y
bacterias lácticas (reacción -)
• Principio: se basa en la propiedad de los
microorganismos aerobios de descomponer el
H2O2 (con liberación de O2) por acción de la
enzima catalasa
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• - Determinación de la catalasa
• Reactivo: solución de peróxido de hidrógeno a
3 volúmenes
• Procedimiento: mezclar en un portaobjeto
una gota del reactivo con una pequeña
porción de colonia joven y observar el
desprendimiento de gas (O2) en forma de
burbujeo
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• Detección , Diferenciación de
Microorganismos y Rcto Directo de Levaduras:
- Recuento directo de levaduras en el
microscopio
• Objetivo: evaluar la población levaduriana
total (viva y muerta)
• Principio: se basa en recuento microscópico
de microorganismos en un volumen conocido
de muestra. Se utilizan cámaras de recuento.
Ej.: cámara de Neubauer
Cámara de recuento
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• - Recuento directo de levaduras en el
microscopio
• Procedimiento: realizado en trabajo práctico
• Importante: realizar por duplicado y efectuar
la media aritmética de los dos conteos
• Resultados: llevarlos al total de cuadraditos
de la cámara, multiplicar por 104 para
expresar células por mililitro y por la dilución
efectuada
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• Recuento de los microorganismos por
cultivo:
• Objetivo: evaluar el nivel de
contaminación de la muestra. Estimar su
estabilidad microbiana. (Solamente
desarrollan los microorganismos viables)
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mostos
• Recuento de los microorganismos por
cultivo:
- Cultivo en medio sólido
• Principio: se basa en el presupuesto que
un microorganismo viable cultivado en o
sobre medio sólido nutritivo específico y
en condiciones convenientes, se multiplica
dando lugar a una colonia visible a
simple vista
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mostos
• - Cultivo en medio sólido
• 1) Cultivo en placas
• Objetivo: efectuar el recuento de
microorganismos cuando la
concentración es elevada, efectuando
diluciones
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• Cultivo en placas
• Procedimiento: se puede realizar por los
métodos de agar volcado o de siembra
masiva
• Se preparan diluciones decimales de la
muestra, de manera tal que se obtenga un
número de colonias entre 30 y 300
• Siembra por el método escogido en los
medios adecuados
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mostos
• Cultivo en placas
• Diluyentes:
• Solución fisiológica
• Solución de Ringer 1/4
• Medios de cultivo:
• Para levaduras: YEPD (extracto de
levadura, peptona, dextrosa, agar,
cloranfenicol)
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mostos
• Cultivo en placas
• Medios de cultivo:
• Para bacterias lácticas: Medio Lafon -
Lafourcade y col., gelosado con actidiona
• Medio Dubois, gelosado con actidiona
• Medio TJB (Tomato juice Broth),
gelosado con actidiona
• (Actidiona o cicloheximida: antifúngico)
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mostos
• Cultivo en placas
• Medios de cultivo:
• Para bacterias acéticas: Medio G2,
gelosado con actidiona
• Medio de Carr, gelosado con actidiona
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• Cultivo en placas
• Incubación:
• Para levaduras: 20 a 25 °C, 3 a 10 días,
en aerobiosis
• Para bacterias lácticas: 25 °C, 4 a 10 días,
en anaerobiosis o microaerofilia
• Para bacterias acéticas: 25 a 30 °C, 2 a 4
días, en aerobiosis
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mostos
• Cultivo en placas
• Efectuar el conteo de colonias a simple
vista o con la ayuda de una lupa
• Resultados: se expresan en Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) /
mililitro, en notación científica con un
decimal. Tener en cuenta las diluciones
efectuadas. Determinar la media
aritmética.
• Especificar el tiempo de incubación
Saccharomyces cerevisiae
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• - Cultivo en medio sólido
• 2) Método de filtración por membrana
• Objetivo: efectuar el recuento de
microorganismos cuando la
concentración es baja. Se efectúa una
concentración. Los microorganismos son
retenidos por una membrana filtrante de
porosidad conveniente luego de filtrar un
volumen determinado de muestra
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mostos
• 2) Método de filtración por membrana
• Procedimiento:
• a) Preparación de las placas con los
medios de cultivo adecuados (líquidos o
sólidos)
• b) Filtración por membrana
Método de filtración por
membrana
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• 2) Método de filtración por membrana
• Procedimiento:
• Para levaduras: membranas filtrantes de
0,45 ó 0,80 μ, medio YEPD gelosado,
incubar en aerobiosis, 20 a 25 °C, 3 a 10
días
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mostos
• 2) Método de filtración por membrana
• Procedimiento:
• Para bacterias lácticas: membranas
filtrantes de 0,20 ó 0,45 μ, medio de
cultivo gelosado, incubar en anaerobiosis
o microaerofilia, a 25 °C, hasta 10 días
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mostos
• 2) Método de filtración por membrana
• Procedimiento:
• Para bacterias acéticas: membranas
filtrantes de 0,20 ó 0,45 μ, medio de
cultivo gelosado, incubar en aerobiosis,
entre 25 y 30 °C, 2 a 4 días
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mostos
• 2) Método de filtración por membrana
• Efectuar el conteo de colonias a simple
vista o con la ayuda de una lupa
• Resultados: se expresan en Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) /
mililitro. Tener en cuenta las diluciones
efectuadas. Determinar la media
aritmética.
• Especificar el tiempo de incubación y la
porosidad de la membrana utilizada
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mostos
• Recuento de los microorganismos por
cultivo:
- Cultivo en medio líquido. Cantidad más
probable (CMP)
• Objetivo: evaluación de la cantidad de
microorganismos viables en los vinos que
tienen tenores elevados en partículas
sólidas en suspensión y/o índices elevados
de colmatación
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mostos
• - Cultivo en medio líquido. Cantidad más
probable (CMP)
• Principio: estimación de la cantidad de
microorganismos viables en medio
líquido, partiendo del principio de su
distribución normal en la muestra
• Procedimiento:
- Se preparan varias diluciones
cuantitativas y sucesivas.
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mostos
• - Cultivo en medio líquido. Cantidad más
probable (CMP)
• Procedimiento:
- Se preparan varias diluciones
cuantitativas y sucesivas
- Se utilizan medios de cultivo líquidos
(medio YEPD sin agar para levaduras y
MTJ para bacterias lácticas)
- Se efectúan las inoculaciones
- Incubación
 Análisis microbiológico de vinos y
mostos
• - Cultivo en medio líquido. Cantidad más
probable (CMP)
• Resultados:
• Se consideran positivos aquellos tubos
que presentan desarrollo microbiano
formación de sedimento blanquecino y/o
enturbiamiento. Confirmar por
microscopía
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mostos
• - Cultivo en medio líquido. Cantidad más
probable (CMP)
• Resultados:
• Se anota la cantidad de tubos positivos o
negativos de cada combinación de tres
tubos (de cada dilución)
• Se determina CMP por medio de tablas.
Estas están basadas en los cálculos de
probabilidades de Mc Crady,
considerando la dilución más adecuada
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mostos
• - Cultivo en medio líquido. Cantidad más
probable (CMP)
• Expresión de los resultados:
• El tenor en microorganismos del vino
debe expresarse en gérmenes / mililitro,
en notación científica con un decimal. Si
es inferior a 1, debe presentarse como
< 1,0 gérmenes / ml
 Nuestro objetivo:
Obtener el mejor producto

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