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Cromatografía de intercambio

catiónico

Separaciones analíticas
QFB. Karla Santamaria

Semestre Enero-Junio
Introducción Cromatografía
intercambio
iónico
Tratamiento

CEX
Gradiente salino
pI>7

Ac. monoclonales

Fragmentos de
Ac. monoclonales E.coli
Metodología
Estudio
Expresión del
farmacocinético
fragmento de Ac.
del fragmento de
usando E.coli
Ac.

Cromatografía Estudio de
analítica de dicroísmo circular,
intercambio de la variación del
catiónico fragmento de Ac.

Cromatografía de Cromatografía
afinidad CEX
Cromatografía -Las variantes cargadas de Ac. Se evaluaron mediante (CEXHPLC).
analítica de
intercambio -CEXHPLC, se empleo para determinar la concentración de
catiónico proteína y la pureza

Se inyectaron 100 μL de muestra de proteína en una columna Agilent BioMab (4.6


× 250 mm) calentada a 30 ° C.
Gradiente con reequilibrio a 0.4 ml/min durante 65 min
Se cuantifico el área de los picos en relación con la proteína de referencia.
Se uso acetato sódico 20 mM a pH 5,2 (tampón A) y acetato sódico 20 mM con
NaCl 1 M a pH 5,2 (tampón B) como fases móviles.
La proteína se detectó usando un detector de UV a 280 nm.

Todas las separaciones se realizaron en un


instrumento de la serie Agilent HPLC 1100
Cromatografía de -Purificación de los fragmentos de Ac.
afinidad

Se clarifico el derivado de E. coli y se cargó en una columna Kappaselect a 1.7 g de


proteína/L de resina.
La columna se lavó con un tampón de fosfato de sodio a pH neutro y el producto
se eluyó a pH acido.
El producto eluido se ajustó a pH 6.0 usando una base Tris 1 M. Se filtró y
almacenó a 5 ° C.
Cromatografía El material previamente purificado se desaló a pH 6.2 con tampón MES (acido 2-
CEX (N- morfolino) etanosulfónico) 20 mM usando una unidad de filtro centrífugo y
se inyecto en la columna.

ISOCRATICO GRADIENTE pH
CM SP SP
Capto S Capto S
Sepharose ImpRes ImpRes
La columna se preequilibró con tampón Material preparado a pH 5.8
MES a 20 mM. Columna preequilibrada
La proteína unida se eluyó usando un La proteína se eluyó con un gradiente de
gradiente de cloruro de sodio 50 mM a 20 columnas de volumen a pH 6.2 a una
una velocidad de 150 cm/h. velocidad de 150 cm/h.
Las fracciones se recogieron y se Las fracciones se recogieron y se
evaluaron para el contenido de la evaluaron para el contenido de la
variante cargada variante cargada usando el ensayo
analítico de intercambio catiónico.
Estudio de dicroísmo circular, de la variación del
fragmento de Ac.

Para evaluar el efecto de las variantes de Los fragmentos de El espectro cercano a UV se obtuvo
carga sobre las propiedades de las anticuerpo se desalaron en usando un espectrómetro Chirascan a
proteínas, especialmente la estructura del agua desionizada y se 250-320 nm. Los resultados se
fragmento de anticuerpo. diluyeron a 0.5 mg/ml. compararon con los de la proteína de
referencia.

Estudio farmacocinético del fragmento de Ac.


Para evaluar comparabilidad entre el fragmento separado y sin procesos de separación de carga.

Fragmento separado
Se tomaron muestras de sangre y se
analizaron mediante ELISA.
Fragmento sin separación Los parámetros se obtuvieron
mediante software y se compararon
Proteína de referencia con los de referencia.
Resultados
Expresión del fragmento de Ac. usando E.coli

Se produjo un fragmento de anticuerpo en E. coli. Cada cadena expresó por separado en E.


coli y luego se plegó para formar el fragmento de anticuerpo.
Se demostró que gran parte del fragmento Ac. plegó adecuadamente, también existía una
proteína mal plegada.
Con la columna Kappaselect, se unió la cadena ligera kappa del anticuerpo, usada para
purificar fragmento de anticuerpo ensamblado apropiadamente de proteína plegada
incorrectamente, cadenas sencillas y proteínas de célula huésped de E. coli.
Sin embargo, con la evaluación de CEX-HPLC analítica, se observaron varios picos distintos
del fragmento de anticuerpo deseado, principalmente variantes de carga del fragmento de
anticuerpo (Fig. 1)
Para separa las variantes de carga del fragmento
Purificación CEX con gradiente de sal intacto ya que estas variantes pueden tener efecto
sobre toxicidad, actividad y vida media.
Cuando las fracciones localizadas en el centro del pico principal se evaluaron usando CEX-HPLC, todas las fracciones de las
resinas de intercambio catiónico usando un gradiente de pH exhibieron una pureza superior al 98%, y la mayoría de los
picos de la variante de carga se separaron, excepto uno variante básica más cercana al fragmento de anticuerpo intacto
Cromatografía CEX con gradiente salino retuvo un
Purificación CEX con gradiente de pH pico en la variante básica cercana al pico de elución
principal. Para separar esta variante básica se aplicó
cromatografía de intercambio catiónico con gradiente
de pH.
Gradiente de pH estrecho de 5.8 a 6.2
Pico eluido de gradiente a pH
Estudio de CD

En comparación con la proteína de referencia, el fragmento de Ac. sin proceso de


separación mostró una diferencia en la señal de CD a 265-280 nm.
El fragmento de anticuerpo con el proceso de separación de la mostró una señal de CD
similar a la de la proteína de referencia, mostrando que la separación influiría en las
propiedades del fragmento de Ac.
Farmacocinética

Se notó que las variantes de carga modifican las propiedades in vivo del fragmento
de anticuerpo.
Debido a que la farmacocinética es una de las propiedades importantes en los
productos farmacéuticos, un proceso eficiente para la separación de las variantes de
carga sería crucial para los fragmentos de anticuerpos y otras proteínas relacionadas
Conclusiones

Se produjo un fragmento de anticuerpo usando expresión de E. coli recombinante.


El fragmento de anticuerpo que contenía variantes de carga se purificó usando
cromatografía de afinidad, luego cromatografía de intercambio catiónico usando diversas
resinas catiónicas con una sal o gradiente de pH.
La resina SP ImpRes con un gradiente de pH exhibió una separación de variante de carga
eficiente
El análisis de CD y farmacocinético reporta que las variantes de carga en los fragmentos de
anticuerpos muestran diferentes propiedades respecto a la proteína de referencia