corriente de 140 V

Western blot 120 minutos

PBS-Tween
con 5% de
Geles electroforéticamente
leche
desnatada
en polvo

0,45 micrómetros
Antígeno
IgY (trypomastigotes
conjugado de peroxidasa de
de T. cruzi)

tripomastigotes de Trypanosoma evansi

IgY IgY anti-pollo de conejo

(1: 2000)
solución en
desarrollo (DAB- PBS-Tween
diaminobenzidin T evansi
a, Tris HCl, níquel y T. cruzi
sulfato al 0,3% y IgY anti-T recién sintetizado
H2O2)
 ELISA
4 ºC
tampón salino (SB - pH 7,2)
antígeno de T. cruzi (1 μg /
pocillo) diluido en 0,05 M de
tampón de carbonato (pH 9,6).
IgY
(3, 5, 7, 9, 10, 11, 13) se
diluyeron (1: 1000, 1:
2000 y 1: 5000) en FBS
y SB
37 ºC
100 μL de suero fetal bovino (FBS)
SB-Tween (SB pH 7,4 con Tween 20 al 0,05%)
SBS-Tween
anticuerpo secundario (conjugado de peroxidasa IgY anti-pollo
de conejo) diluido a 1: 3000
1 h a 37 ºC.
100 μl del sustrato cromogénico (ortofenilendiamina,
OPD)
bloqueó con 10 μL de H2SO4
490 nm usando un espectrofotómetro.
 Evaluación de la citotoxicidad de IgY
Células mononucleares de sangre periférica (CMSP) Cultivo celular VERO

linfocitos se separaron mediante Histopaque 1077

centrifugación en gradiente de densidad utilizando 4 ml de

muestras de sangre

5 ml de RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, 1% de

penicilina y estreptomicina.

microplaca de 96 pocillos a una densidad inicial de 2 x 105
durante 24 y 72 horas a 37 ° C en una atmósfera de CO2
humidificado al 5%
E-MEM suplementado con FBS al 10%
(v / v) ( Gibco BRL), 1% (v / v) L-
glutamina (200 mmol L1), 10 mg / ml-
1 ciprofloxacina (Baytril, Bayer), y
0.025 g / ml-1 anfotericina B (Gibco
BRL)
 Viabilidad celular

1, 5 y 10 mg / ml de IgY anti-T. cruzi

método colorimétrico MTT 3- (4,5dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil
tetrazolio bromuro

50 μl de solución de MTT a cada pocillo

200 μl l de dimetilsulfóxido (DMSO)

ELISA a una longitud de onda de 560 nm.

Análisis Estadístico
Shapiro-Wilk y
normalidad y homocedasticidad Levene

diferencias significativas ANOVA

post hoc de Tukey

Resultados
Concentración de
anticuerpos IgY

Entre la 3ra y 13ra

semana fue de 8,41 ±
1,47 mg / ml.

Electroforesis en gel SDS-

PAGE

75 y 50 kDa  Cadena pesada

IgY
37 y 25 kDa  Cadena ligera IgY Protocolo de extracción fue efectivo en la separación de IgY
.
Resultados
La segunda membrana
Ensayo Western blot transferida electroforéticamente
Primera transferencia de Western

Las bandas encontradas en el gel de Reaccionó con las proteínas de T. cruzi y T. evansi
electroforesis que tienen el mismo peso Indica reactividad cruzada.
molecular se refieren a IgY
 Inmunoterapia
Identificar tratamientos Método de Sampaio et al.
que sean más (2014) es eficaz y fácil de
eficientes y menos implementar para la
tóxicos contra T.cruzi, producción de IgY anti-T.
cruzi

104 y 103 tripomastigotes de T. cruzi, 8.41 mg / ml

107 tripomastigotes de T. evansi  2,7 mg / ml.

Método de precipitación de sal utilizando PEG-

Aislar y purificar IgY de pollo 6000
activa funcional de la yema de • Fácil de realizar
huevo. • Anticuerpo eficaz de alto rendimiento
• Manipulación a temperatura ambiente sin
Precipitación salina riesgo de desnaturalización de la
Técnicas cromatográficas
Ultrafiltración.
inmunoglobulina.