ANÁLISIS DE LAS PROTEÍNAS

CONSIDERACIONES
GENERALES
 PROTEÍNAS
 SON COMPONENTES ABUNDANTES EN TODAS
LAS CÉLULAS.

 CASI TODAS (EXCEPTO LAS DE

ALMACENAMIENTO) SON IMPORTANTES PARA
LAS FUNCIONES BIOLÓGICAS Y/O LA
ESTRUCTURA CELULAR.

 LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS SON MUY

COMPLEJAS.
COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS

 ESTÁN CONSTITUÍDAS POR: HIDRÓGENO,

CARBONO, NITRÓGENO, OXÍGENO Y AZÚFRE.

 LOS “BLOQUES DE CONSTRUCCIÓN” DE LAS

PROTEÍNAS SON 20
∞-AMINOÁCIDOS.

 LAS UNIONES ENTRE RESIDUOS DE

AMINOÁCIDOS EN UNA PROTEÍNA SON
ENLACES PEPTÍDICOS.
COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS

 EL NITRÓGENO ES EL ELEMENTO MÁS DISTINTIVO

PRESENTE EN LAS PROTEÍNAS.

 GENERALMENTE LAS PROTEÍNAS RICAS EN

AMINOÁCIDOS BÁSICOS CONTIENEN MÁS NITRÓGENO.

 SIN EMBARGO, EL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN

VARIAS PROTEÍNAS ALIMENTICIAS VARÍA DE 13.4
19.1% DEBIDO A LA VARIACIÓN EN LA COMPOSICIÓN
DE AMINOÁCIDOS ESPECÍFICA DE LAS PROTEÍNAS.
 CLASIFICACIÓN DE LAS
PROTEÍNAS
 COMPOSICIÓN

 ESTRUCTURA

 FUNCIÓN BIOLÓGICA

 PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD
COMPLICACIONES EN EL
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

CARACTERÍSTICAS FÍSICO QUÍMICAS

DE LOS ALIMENTOS SIMILARES A LOS
DE LAS PROTEÍNAS
 FUENTES DE NITRÓGENO NO
PROTÉICO
 AMINOÁCIDOS LIBRES
 PEQUEÑOS PÉPTIDOS
 ÁCIDOS NUCLÉICOS
 FOSFOLÍPIDOS
 AZÚCARES AMINAS
 PORFIRINA
 ALGUNAS VITAMINAS
 FUENTES DE NITRÓGENO
NO PROTÉICO

 ALCALOIDES
 ÁCIDO ÚRICO
 UREA
 IONES DE AMONIO
OTROS MACROCOMPONENTES DE
LOS ALIMENTOS QUE PUEDEN
INTERFERIR CON EL ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS

 LÍPIDOS

 CARBOHIDRATOS
MÉTODOS DESARROLLADOS PARA
MEDIR EL CONTENIDO PROTÉICO
FUNDAMENTOS:
 DETERMINACIONES DE NITRÓGENO

 ENLACES PEPTÍDICOS

 ÁCIDOS AROMÁTICOS

 ABSORTIVIDAD UV DE LAS PROTEÍNAS

 GRUPOS AMINO LIBRES

 PROPIEDADES DE DISPERSIÓN DE LA LUZ

 CAPACIDAD DE ADHESIÓN DE COLORANTES

 IMPORTANCIA DEL ANÁLISIS
DE PROTEÍNAS

 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA.

EJEMPLO: PECTINASAS DURANTE LA
MADURACIÓN DE FRUTOS.

 INVESTIGACIÓN SOBRE PROPIEDADES

FUNCIONALES. EJEMPLO: GLIADINA Y
GLUTENINAS PARA LA ELABORACIÓN DEL PAN.

 ETIQUETAMIENTO NUTRICIONAL
 NECESIDAD DEL ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS

 CONTENIDO PROTÉICO TOTAL

 COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS
 CONTENIDO DE ALGUNA PROTEÍNA
PARTICULAR EN UNA MEZCLA
 CONTENIDO PROTEÍCO DURANTE EL
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE UNA
PROTEÍNA
 NITRÓGENO NO PROTÉICO
 VALOR NUTRITIVO DE UNA PROTEÍNA
(DIGESTIBILIDAD, BALANCE PROTÉICO)
 CONTENIDO PROTÉICO
EN LOS ALIMENTOS

 PRODUCTOS LÁCTEOS
LECHE ENTERA 3.5%
LECHE DESHIDRATADA DESGRASADA 35.9%
QUESO CHEDDAR 25%

 HUEVOS 12.9%
 CONTENIDO PROTÉICO EN LOS
ALIMENTOS
 CARNES
RES, BISTEAK, MAGRO CON GRASA 28.6%
PUERCO, MAGRO CON GRASA, DESHUESADO
17.1%
PECHUGA DE POLLO 27.3%
 PESCADO

BACALAO COCINADO 28.5%

ATÚN EN ACEITE ENLATADO 24.2%
 CONTENIDO PROTÉICO EN
LOS ALIMENTOS
 CEREALES
ARROZ, INTEGRAL, CRUDO 7.5%
ARROZ REFINADO, CRUDO 6.7%
HARINA DE TRIGO INTEGRAL 13.3%
HARINA DE MAÍZ 7.8%
SPAGHETTI, SECO 12.5%
ALMIDÓN DE MAÍZ 0.3%
 CONTENIDO PROTÉICO EN
LOS ALIMENTOS

 FRUTAS Y VEGETALES
PAPA ENTERA, CRUDA 1.6%
ESPÁRRAGOS VERDES 2.5%
TAPIOCA 0.6%
FRIJOLES, SECOS, TODAS LAS VARIEDADES
22.3%
SOYA SECA 34.1%
 CONTENIDO PROTÉICO EN LOS
ALIMENTOS
 FRUTAS Y SEMILLAS
MANZANA ENTERA, CRUDA 0.2%
CEREZA 0.9%
DURAZNO 0.8%
DURAZNO DESHIDRATADO 3%
UVA PASA 2.5%
PERA 0.5%
FRESA 0.8%

ALMENDRAS ENTERAS 18.6%

 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
DE PROTEÍNAS
 MÉTODO DE KJELDAHL
 MÉTODO DE BIURET
 MÉTODO DE LOWRY
 MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
 MÉTODO DE ABSORCIÓN UV A 280nm
 MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE
 MÉTODO DE BRADFORD
 MÉTODO DE LA NINHIDRINA
 MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
 MÉTODO DE KJELDAHL
(JOHANN KJELDAHL, 1883)
 DIGESTIÓN CON H2SO4 CON LA ADICIÓN DE
PERMANGANATO DE POTASIO PARA COMPLETAR LA
OXIDACIÓN Y CONVERSIÓN DEL NITRÓGENO A
SULFATO DE AMONIO.

 NEUTRANLIZACIÓN DE LA DIGESTA DILUIDA,

SEGUIDA DE UNA DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN
CONOCIDO DE ÁCIDO ESTÁNDAR CON UN CONTENIDO
DE IODURO DE POTASIO E YODATO.

 TITULACIÓN DEL YODO LIBERADO CON TIOSULFATO

DE SODIO ESTÁNDAR
 MODIFICACIONES PARA EL
MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE
KJELDAHL

 SE HAN AÑADIDO CATALIZADORES

COMO: Hg, Cu, Se, Ti AL H2SO4 PARA
LOGRAR UNA DIGESTIÓN COMPLETA.
EL DIÓXIDO DE SELENIO Y EL SULFATO
DE COBRE EN PROPORCIÓN 3:1 SON MUY
EFECTIVOS EN LA DIGESTIÓN.
 MODIFICACIONES PARA EL
MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE
KJELDAHL
 EL SULFATO DE POTASIO SE UTILIZA PARA
AUMENTAR EL PUNTO DE EBULLICIÓN DEL
ÁCIDO SULFÚRICO PARA ACELERAR LA
DIGESTIÓN.

 EL SULFURO O TIOSULFATO DE SODIO SE

AÑADEN A LA DIGESTA DILUIDA PARA AYUDAR
A LIBERAR EL NITRÓGENO DEL Hg EL CUAL
TIENDE A ADHERIR AMONIO.
 MODIFICACIONES PARA EL
MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE
KJELDAHL
 EL AMONIACO SE DESTILA DIRECTAMENTE EN
UNA SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO Y ES
SEGUIDO DE UNA TITULACIÓN CON UN ÁCIDO
ESTÁNDAR.

 SE UTILIZAN LA COLORIMETRÍA Y LA
CROMATOGRAFÍA IÓNICA PARA DETERMINAR
EL CONTENIDO DE NITRÓGENO POSTERIOR A
LA DIGESTIÓN.
 PROCEDIMIENTO GENERAL
Y REACCIONES

 DIGESTIÓN

EL SULFATO DE AMONIO NO VOLÁTIL SE FORMA DE LA

REACCIÓN DEL NITRÓGENO Y EL ÁCIDO SULFÚRICO.

DURANTE LA DIGESTIÓN SE LIBERA EL NITRÓGENO

PROTÉICO PARA FORMAR IONES DE AMONIO.

EL ÁCIDO SULFÚRICO OXIDA LA MATERIA ORGÁNICA Y

SE COMBINA CON EL AMONIO FORMADO.
 DIGESTIÓN

 LOS ELEMENTOS CARBONO E

HIDRÓGENO SE CONVIERTEN EN
DIÓXIDO DE CARBONO Y AGUA
Ácido Sulfúrico
PROTEÍNA (NH4)2 SO4
Calor, catalizador
 NEUTRALIZACIÓN Y
DESTILACIÓN

 LA MUESTRA DIGERIDA SE DILUYE CON AGUA.

 SE AÑADE EL ÁLCALI QUE CONTIENE

TIOSULFATO DE SODIO PARA NEUTRALIZAR AL
ÁCIDO SULFÚRICO.

 EL AMONÍACO FORMADO SE DESTILA EN UNA

SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO QUE CONTIENE
LOS INDICADORES AZÚL DE METILENO Y ROJO
DE METILO.
 REACCIONES DE LA
NEUTRALIZACIÓN Y LA
DESTILACIÓN
(NH)2SO4+ 2NaOH → 2NH3+Na2SO4+2H2O

NH3+ H3BO3 → NH4 + H2BO3-

(ácido bórico) (ión borato)
 REACCIONES DE LA
TITULACIÓN

 EL ANIÓN BORATO (PROPORCIONAL A LA

CANTIDAD DE NITRÓGENO) SE TITULA
CON HCl ESTANDARIZADO:

H2BO3- + H+ → H3BO3
 CÁLCULOS

MOLES DE HCl = MOLES DE NH3 = MOLES

DE NITRÓGENO EN LA MUESTRA
 FUNCIÓN DEL BLANCO EN LA
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

 SE DEBE UTILIZAR UN BLANCO CON

REACTIVOS PARA SUSTRAER EL
NITRÓGENO REACTIVO DEL NITRÓGENO
DE LA MUESTRA.
 N HCl = NORMALIDAD DEL HCl EN MOLES /1000 mL
 VOL. ÁCIDO CORREGIDO = mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR
PARA LA MUESTRA) – (mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR PARA
EL BLANCO)
 14 = PESO ATÓMICO DEL NITRÓGENO

%N = N HCl X VOLUMEN DE ÁCIDCORR.

g. DE MUESTRA
X 14g N2 X 100
MOL
 FACTOR
 SE UTILIZA UN FACTOR DE CONVERSIÓN DE % DE N2 A
% DE PROTEÍNA CRUDA.
 LA MAYORÍA DE LAS PROTEÍNAS CONTIENEN 16% DE
N2
 EL FACTOR DE CONVERSIÓN ES:
6.25 (100/16 = 6.25)

%N2 X 6.25 = %PROTEÍNA Ó

%N2 = %PROTEÍNA
0.16
 FACTORES DE CONVERSIÓN
PARA ALGUNOS ALIMENTOS
ALIMENTO %N2PROTEÍNA FACTOR
HUEVO O 16 6.25
CARNE, MAÍZ
LECHE 15.7 6.38
TRIGO 18 5.7
SOYA 17.51 5.71
AVENA 17.15 5.83
PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS
DE DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
NESSLERIZACIÓN
NH4OH + 2HgI2+ 2KI + 3KOH → NH4Hg2I +
7KI + 4H2O ( rojo-naranja, 440nm)

RÁPIDO Y FÁCIL PERO EL IODURO

DIMERCÚRICO DE AMONIACO ES
COLOIDE Y EL COLOR ES INESTABLE
PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS
DE DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
 MEDICIÓN DEL pH POSTERIOR A LA
DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN
CONOCIDO DE ÁCIDO BÓRICO

 MEDICIÓN DIRECTA DEL AMONÍACO,

MEDIANTE EL MÉTODO DE
CROMATOGRAFÍA IÓNICA
 VENTAJAS DEL MÉTODO DE
KJELDAHL

 APLICABLE A TODO TIPO DE ALIMENTOS

 RELATIVAMENTE SIMPLE
 BARATO
 PRECISO
 ES EL MÉTODO OFICIAL PARA MEDIR EL
CONTENIDO DE PROTEÍNA CRUDA
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO
DE KJELDAHL

 MIDE EL NITRÓGENO ORGÁNICO TOTAL,

NO SÓLO EL NITRÓGENO PROTÉICO
 CONSUME MUCHO TIEMPO (AL MENOS 2
HORAS PARA COMPLETARSE)
 PRECISIÓN MÁS POBRE QUE EL MÉTODO
DE BIURET
 USA REACTIVOS CORROSIVOS
 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
POR EL MÉTODO DE BIURET
 FUNDAMENTO

AL FORMAR COMPLEJOS LOS IONES CÚPRICOS CON LOS ENLACES

PEPTÍDICOS DE LAS PROTEÍNAS SE PRODUCE UN COLOR
VIOLETA-MORADO BAJO CONDICIONES ALCALINAS.

LA ABSORBANCIA DEL COLOR PRODUCIDO ES LEÍDO A 540nm.

LA INTENSIDAD DEL COLOR (ABSORBANCIA) ES PROPORCIONAL AL

CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA.
 PROCEDIMIENTO PARA EL
MÉTODO DE BIURET

 5 mL DE REACTIVO DE BIURET SE MEZCLA CON

1mL DE SOLUCIÓN PROTÉICA (1-10 mg DE
PROTEÍNA/mL).

EL REACTIVO INCLUYE SULFATO DE COBRE,

NaOH, Y TARTRATO DE SODIO Y POTASIO EL
CUAL SE UTILIZA PARA ESTABILIZAR EL IÓN
COBRE EN LA SOLUCIÓN ALCALINA
 PROCEDIMIENTO PARA EL
MÉTODO DE BIURET
 DESPUÉS DE REPOSO A TEMPERATURA
AMBIENTE DURANTE 15 A 30 MINUTOS, SE LEE
LA ABSORBANCIA A 540nm CONTRA UN
BLANCO CON SÓLO REACTIVO.

 SI LA REACCIÓN NO ES CLARA DEBE

CENTRIFUGARSE LA MUESTRA PREVIO A LA
LECTURA DE LA ABSORBANCIA
 PROCEDIMIENTO PARA EL
MÉTODO DE BIURET

 SE DEBE ELABORAR UNA CURVA

ESTÁNDAR DE CONCENTRACIÓN VS
ABSORBANCIA UTILIZANDO ALBÚMINA
DE SUERO DE BOVINO (BSA) PARA
COMPARACIÓN CON LA MUESTRA BAJO
ESTUDIO
 VENTAJAS DEL MÉTODO DE
BIURET
 MENOS CARO QUE EL MÉTODO DE KJELDAHL
 RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30
MINUTOS)
 ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS
 NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE
COLOR
 POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN
CON LA REACCIÓN DE BIURET
 NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO
PEPTÍDICAS
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
BIURET
 NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO
DE LOWRY
 REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR
PRUEBA
 LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO
INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
 PUEDE OCURRIR OPALESCENCIA EN LA SOLUCIÓN
FINAL SI ESTÁN PRESENTES ALTAS CONCENTRACIONES
DE LÍPIDOS O CARBOHIDRATOS
 DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE
CANTIDADES DE PROTEÍNA CONOCIDAS
 MÉTODO DE LOWRY
 FUNDAMENTO
COMBINA LA REACCIÓN DE BIURET CON LA
REDUCCIÓN DEL REACTIVO DE FENOL FOLIN-
CIOCALTEAU (ÁCIDO FOSFOMOLÍBDICO-
FOSFOTÚNGSTICO) POR LOS RESIDUOS DE
TIROSINA Y TRIPTOFANO DE LAS PROTEÍNAS.
EL COLOR AZULOSO DESARROLLADO ES LEÍDO
A 750nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA
CONCENTRACIÓN PROTÉICA BAJA) O A 500nm
(ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA
CONCENTRACIÓN PROTÉICA ALTA)
 VENTAJAS DEL MÉTODO DE
LOWRY

 MUY SENSIBLE
 MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE
LA MUESTRA
 MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE
LOS OTROS MÉTODOS
 RELATIVAMENTE SIMPLE
 SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORAS
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
LOWRY

 EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL

MÉTODO DE BIURET)

 EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE PROPORCIONAL A LA

CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

 LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y

HEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

 LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES,

SULFATO DE AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFHIDRILO
INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
 MÉTODO DEL ÁCIDO
BICINCONÍNICO (BCA)
 FUNDAMENTO
SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LAS
PROTEÍNAS REDUCEN LOS IONES CÚPRICOS A
IONES CUPROSOS BAJO CONDICIONES
ALCALINAS. LOS IONES CUPROSOS
REACCIONAN CON EL BCA (VERDOSO) PARA
FORMAR UN COLOR MORADO. EL COLOR
FORMADO ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO
PROTÉICO DE LA MUESTRA
 VENTAJAS DEL MÉTODO DEL
ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
 SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MÉTODO DE LOWRY (0.5mg
a 10mg)

 LA MEZCLA EN UN PASO ES MÁS FÁCIL QUE EN EL MÉTODO DE

LOWRY

 EL REACTIVO ES MÁS ESTABLE QUE EL REACTIVO DE LOWRY

 LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO IÓNICO NO

INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

 LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS

DESNATURALIZANTES NO INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O
UREA 3M)
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO DEL
ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)

 EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE

NECESITA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO
ENTRE EL ANÁLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA.

 LOS AZÚCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA

REACCIÓN.

 ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO

INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.

 LA RESPUESTA EN LA ABSORBANCIA NO ES LINEAL

 MÉTODO DE ABSORCIÓN EN
ULTRAVIOLETA A 280nm
 FUNDAMENTO

LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE

ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE
DEBIDO A LOS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA
TIROSINA DE LAS PROTEÍNAS. YA QUE LAS
CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS
PROTEÍNAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE
UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA
CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS USANDO LA LEY DE
BEER
 MÉTODO DE ABSORCIÓN EN
ULTRAVIOLETA A 280nm
 FUNDAMENTO

DADO QUE CADA PROTEÍNA TIENE UNA

COMPOASICIÓN ÚNICA DE AMINOÁCIDOS
AROMÁTICOS, EL COEFICIENTE DE EXTINCIÓN
(E280) O SU ABSORTIVIDAD MOLAR (Em) DEBEN
SER DETERMINADOS PARA PROTEÍNAS
INDIVIDUALES PARA LA ESTIMACIÓN DEL
CONTENIDO PROTÉICO
 VENTAJAS DEL MÉTODO DE
ABSORCIÓN EN UV (280nm)

 MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE

(VARIAS VECES MÁS SENSIBLE QUE EL
MÉTODO DE BIURET)
 NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE
AMONIO Y OTRAS SALES BUFFER
 MÉTODO NO DESTRUCTIVO
 UTILIZADO EN DETECCIÓN POST-COLUMNA DE
LAS PROTEÍNAS
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
ABSORCIÓN EN EL UV (280nm)
 LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN
EN LA REGIÓN DE 280nm
 EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS
AROMÁTICOS DIFIERE CONSIDERABLEMENTE
EN VARIAS PROTEÍNAS.
 LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA.
LA TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS
ERRÁTICOS
 SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE
PURO PARA UTILIZAR ESTE MÉTODO
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS POR ADHESIÓN DE UN
COLORANTE

 ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO

 MÉTODO DE BRADFORD
 ADHESIÓN DE COLORANTE
ANIÓNICO
 FUNDAMENTO
LA MUESTRA PROTÉICA SE MEZCLA CON UNA
CANTIDAD EXCESIVA CONOCIDA DE UN
COLORANTE ANIÓNICO EN UNA SOLUCIÓN
BUFFER.

LAS PROTEÍNAS SE UNEN AL COLORANTE PARA

FORMAR UN COMPLEJO INSOLUBLE.
 ADHESIÓN DE COLORANTE
ANIÓNICO
 FUNDAMENTO
SE MIDE EL COLORANTE NO ADHERIDO,
SOLUBLE POSTERIOR A LA EQUILIBRACIÓN DE
LA REACCIÓN Y LA REMOCIÓN DEL COMPLEJO
INSOLUBLE POR CENTRIFUGACIÓN Y
FILTRACIÓN.
EL COLORANTE NO ADHERIDO ESTÁ
INVERSAMENTE RELACIONADO AL CONTENIDO
PROTÉICO DE LA MUESTRA
 ADHESIÓN DE COLORANTE
ANIÓNICO

 FUNDAMENTO

PROTEÍNA + EXCESO DE COLORANTE →

COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE
INSOLUBLE + COLORANTE NO
ADHERIDO SOLUBLE
 COLORANTES UTILIZADOS EN
ESTE MÉTODO
 ÁCIDO SULFÓNICO ANIÓNICO
NARANJA ÁCIDO 12
NARANJA G
NEGRO AMIDO 10B

UNEN GRUPOS CATIÓNICOS DE LOS RESIDUOS

BÁSICOS DE AMINOÁCIDOS (IMIDASOL DE LA
HISTIDINA, GUANIDINA DE LA ARGININA Y EL
GRUPO ε-AMINO DE LA LISINA) Y EL GRUPO
LIBRE TERMINAL AMINO DE LAS PROTEÍNAS.
 VENTAJAS DEL MÉTODO DE
ADHESIÓN DE COLORANTE
ANIÓNICO
 MÉTODO RÁPIDO (15 MINUTOS O MENOS)
 BARATO
 RELATIVAMENTE EXACTO PARA EL ANÁLISIS
DE PROTEÍNAS EN ALIMENTOS
 PUEDE UTILIZARSE PARA ESTIMAR LOS
CAMBIOS EN EL CONTENIDO DE LISINA
DISPONIBLE DE LOS CEREALES DURANTE SU
PROCESAMIENTO.
 VENTAJAS DEL MÉTODO DE
ADHESIÓN DE COLORANTE
ANIÓNICO

 NO UTILIZA REACTIVOS CORROSIVOS

 NO MIDE NITRÓGENO NO PROTÉICO
 MÁS PRECISO QUE EL MÉTODO
KJELDAHL
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA
ADHESIÓN DEL COLORANTE
ANIÓNICO
 LAS PROTEÍNAS DIFIEREN EN SU CONTENIDO DE
AMINOÁCIDOS BÁSICOS DIFIEREN EN SU CAPACIDAD
DE ADHESIÓN DEL COLORANTE

 SE NECESITA ELABORAR CURVA DE CALIBRACIÓN

 MUCHOS COMPONENTES NO PROTÉICOS TAMBIÉN SE

PUEDEN ADHERIR AL COLORANTE (ALMIDÒN),
METALES (Ca O P) Y CAUSAR ERRORES EN LOS
RESULTADOS
 MÉTODO DE BRADFORD
 FUNDAMENTO

EL AZÚL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE

ADHIERE A LA PROTEÍNA, EL COLORANTE SE
TORNA DE ROJIZO A AZULADO Y EL MÁXIMO
DE ABSORCIÓN DEL COLORANTE CAMBIA DE
465 A 595nm. EL CAMBIO EN LA ABSORBANCIA
A 595nm ES PROPORCIONAL A LA
CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN LA
MUESTRA.
 VENTAJAS DEL MÉTODO DE
BRADFORD
 MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE PUEDE
COMPLETAR EN 2 MINUTOS)

 REPRODUCIBLE

 SENSIBLE (MUCHO MÁS QUE EL MÉTODO DE

LOWRY)

 NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES

COMO K+, Na+, Y Mg+
 VENTAJAS DEL MÉTODO DE
BRADFORD

 NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE

AMONIO

 NO EXISTE INTERFERENCIA DE LOS

POLIFENOLES NI CARBOHIDRATOS COMO LA
SACAROSA

 MIDE PROTEÍNA O PÉPTIDOS CON UNA MASA

MOLECULAR APROXIMADAMENTE IGUAL O
MAYOR DE 4 000 DALTONS
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
BRADFORD

 EL COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE FORMADO

PUEDE UNIRSE A LAS CELDAS DE CUARZO

 EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES TIPOS DE

PROTEÍNAS.

 LA PROTEÍNA ESTÁNDAR DEBE SELECCIONARSE CON

MUCHO CUIDADO

 INTERFERENCIA CON DETERGENTES.

 MÉTODO DE LA NINHIDRINA
 FUNDAMENTO

AL SER HERVIDOS EN UN BUFFER A UN

pH DE 5.5 EN PRESENCIA DE
NINHIDRINA E HIDRINDANTINA, LOS
AMINOÁCIDOS, AMONÍACO, Y LOS
GRUPOS AMINO PRIMARIOS, ORIGINAN
UN COLOR MORADO RUHEMANN
 VENTAJA DEL MÉTODO DE LA
NINHIDRINA

 MÉTODO RELATIVAMENTE RÁPIDO SI SE

COMPARA CON EL MÉTODO DE KJELDAHL
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA
NINHIDRINA

 LA PRESENCIA DE PEQUEÑAS CANTIDADES DE

AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS, AMINAS PRIMARIAS, Y
AMONÍACO OCASIONA UNA SOBREESTIMACIÓN DEL
CONTENIDO PROTÉICO

 BAJA PRECISIÓN

 EL COLOR VARÍA CON LA DIFERENTE COMPOSICIÓN DE

AMINOÁCIDOS

 SE NECESITA ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR EN

CADA ANÁLISIS
 MÉTODO TURBIDIMÉTRICO DE
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

 FUNDAMENTO

SE PUEDEN UTILIZAR BAJAS

CONCENTRACIONES (3-10%) DE ÁCIDO
TRICLOROACÉTICO, ÁCIDO SULFOSALICÍLICO,
Y FERRICIANURO DE POTASIO EN ÁCIDO
ACÉTICO PARA PRECIPITAR LAS PROTEÍNAS
EXTRAÍDAS PARA FORMAR UNA SUSPENSIÓN
TURBIA DE PARTÍCULAS PROTÉICAS.
 MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
 FUNDAMENTO

LA TURBIDEZ PUEDE SER MEDIDA DE LA

REDUCCIÓN DE LA TRANSMISIÓN DE LA
RADIACIÓN. LA REDUCCIÓN EN LA
TRANSMISIÓN DE LA RADIACIÓN SE DEBE A LA
DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN POR LAS
PARTÍCULAS PROTÉICAS. LA INTENSIDAD DE
LA REDUCCIÓN DE LA RADIACIÓN SE PUEDE
RELACIONAR CON LA CONCENTRACIÓN DE
PROTEÍNA EN LA SOLUCIÓN
 VENTAJAS DEL MÉTODO
TURBIDIMÉTRICO

 MÉTODO RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR

EN 15 MINUTOS)

 NO MIDE EL NITRÓGENO NO PROTÉICO

DIFERENTE DE LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO
TURBIDIMÉTRICO

 DIFERENTES PROTEÍNAS SE PRECIPITAN A

DIVERSAS VELOCIDADES.

 LA TURBIDEZ VARÍA CON DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE REACTIVOS ÁCIDOS.

 LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN SE

PRECIPITAN MEDIANTE REACTIVOS ÁCIDOS