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EXPOSITORAS:

•BENDEZU ANGULO KAREN


•VILLANUEVA SOLGORRE ROSARIO
CAPITULO I :
GENERALIDADES
1.1 MOLLE
Reino : Plantae
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Orden : Sanpidales
Familia : Anacardiaceae
Género : Schinus
Especie : Schinus molle L.
• ARBOL DE LA VIDA
• ARBOL DE PERÚ
PERU • FALSO PIMENTERO

• ANACAHUITE
MEXICO
• PIRÚ

ARGENTINA
• AGUARIBAY
Arbusto o arbolillo perennifolio de hasta 10m. de alto.
• TALLO: Ramoso , hasta de 1 m. de longitud
• HOJAS: alternas, pinnadas, hasta 35 cms. de largo,
raquis ligeramente alado; folíolos sésiles, el terminal
en general presente y los laterales terminados en
acumen opuesto al raquis; pecíolo 2-4 cms. de
largo.
• FLORES: pequeñas, muy numerosas, uni ó
bisexuales ,pentámeras
• FRUTOS: drupa esférica de 5 mm. de diámetro de
color rosado oscuro brillante: semillas negras, lisas y
opacas.
• Es oriundo del Perú y abunda también en
Argentina, Chile, Ecuador y Bolivia. Cultivado
como árbol ornamental en México y Estados
Unidos.
• En el Perú se le encuentra hasta los 3300
msnm. En los andes del sur y 3000msnm de
los andes del centro.
Hojas y frutos. En
menor medida la
Corteza.
• Hojas :
Contienen flavonoides, pigmentos
antocianìdicos, Mirceno, fenoles,
triterpenos y aceite esencial (0,5%).
Además de los ácidos linolénico, linoleico,
lignocérico y esteárico.
• Frutos : Contiene aceite esencial(2,4%),
proteínas, sustancias reductoras.
• Afecciones respiratorias (bronquitis, tos)
Parte usada : ramas jóvenes, hojas
• Reumatismo y procesos inflamatorios :
Parte usada : hojas
• Tratamiento de hepatitis :
Parte usada : hojas
• Cicatrizante :
Parte usada : corteza (tallo), hojas y resina
• Depurativo :
Parte usada : hojas
• Hemostático :
Parte usada : frutos
• Antiespasmódico :
Parte usada : hojas
• Actividad antibacteriana:
• Actividad antimicótica:
• Actividad insecticida:
• Actividad antiinflamatoria:
• Otras acciones
ACTIVIDAD
1.2 ANTIMICROBIANA
• Por su origen:

Origen Origen Origen


natural semisintetico sintético
• Por su efecto:
- Bacteriostático
- Bactericida
• Por espectro de actividad:
- Amplio
- Intermedio
- Reducido
Mecanismo de acción
a) Inhibición de la síntesis de la pared celular
b) Alteración de la permeabilidad celular
c) Inhibición de la síntesis proteica
d) Inhibición de la síntesis de ADN y ARN
Cepa utilizada de: Staphylococcus aureus

Los estafilococos son células esféricas


grampositivas que suelen estar distribuidas
en grupos irregulares a manera de racimos;
este microorganismo es positivos a la
coagulasa y patógeno de gran importancia
para el ser humano, y es el causante de
muchas infecciones graves.
Cepa utilizada de: Escherichia coli

Es una bacteria
anaerobia gram negativa que
se encuentra comúnmente en el
intestino de los seres humanos y
animales de sangre caliente, la
ingesta de estos alimentos
contaminados desencadena
cuadros diarreicos la mayoría
decepas
son inofensivas
GRUPOS FITOQUÍMICOS
1.3 ANTIMICROBIANOS
TERPENOIDES Y
ACEITES
ESCENCIALES

FENOLES Y
POLIFENOLE
S Schinus FLAVONAS,
molle FLAVONOIDES
Y FLAVONOLES

QUINONAS,
TANINOS ,
CUMARINAS Y
ALCALOIDES
MÉTODOS PARA LA
1.4 DETERMINACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA.
Este método se basa en la
determinación del crecimiento
antimicrobiano.
 concentración mínima
inhibitoria CMI)

Es empleado para determinar la sensibilidad de un agente


microbiano frente a un antibiótico o quimioterapéutico.
SE EMPLEO METODO DE DIFUSION DE DISCO
CAPITULO III:
PARTE EXPERIMENTAL
Material vegetal:
Materiales de Laboratorio: • Hojas deSchinus molle L. (Molle).
• Tubos de ensayo 15 x20
• Tubos de ensayo 13x100 Material Biológico:
• Gradillas para tubos • Cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
• Balones • Cepas de Escherichia coli (ATCC 25922).
• Probeta de 100 mL.
• Percolador Medios de Cultivo:
• Agar Mûller-Hinton
Equipos de Laboratorio: • Caldo nutritivo
• Autoclave
• Destilador Control Positivo:
• Estufa • Cloranfenicol (25 mg/mL.).
• Cocinilla eléctrica
• Campana bacteriológica de flujo laminar Control Negativo:
• Baño maría • Etanol de 96º
• Agua destilada
Reactivos e insumos:
• Etanol 96º Otros materiales :
• Diclorometano • Guantes
• Agua destilada • Mascarillas
Droga: Schinus Molle

“ Molle ”
RECOLECCIÓN
RECOLECCIÓN
Y
TRATAMIENTO
DE SELECCIÓN-
LA LIMPIEZA

MUESTRA
SECADO

MOLIENDA

ALMACENAMIENTO
• Se realizó el screening fitoquímico utilizando
las hojas de Schinus molleL. “Molle”, siguiendo
la técnica modificada de LAPRONAT
(Laboratorio de Productos Naturales) a fin de
identificar los metabolitos secundarios, este
análisis es de carácter cualitativo, para lo cual
se extraen diferentes fracciones a las cuales se
le realiza reacciones químicas de coloración
y/o precipitación que sirven para identificar
los metabolitos secundarios
OBTENCIÓN DE LAS FRACCIONES:
• Fracción A FRACCION D: Sobre esta fracción se realiza directamente la reacción de:
• Fracción B • REACCION DE LIEBERMAN-BUCHARD
• Fracción C • REACCION PARA ALCALOIDES
• Fracción D • REACCION DE ROSENHEIN
• Fracción E • REACCION DE SHINODA
• Fracción F
FRACCION E: Sobre esta fracción se realiza directamente los ensayos de:
IDENTIFICACION DE METABOLITOS SECUNDARIOS: • REACCION DE ROSENHEIN
• REACCION DE SHINODA
FRACCION A: •
FRACCION F:
• REACCIÓN DE GELATINA • PRUEBA DE ESPUMA
• REACCIÓN DE CLORURO FÉRRICO

FRACCION B: Sobre esta fracción se realizan directamente los ensayos de:


• REACCION LIEBERMAN-BURCHARD.
• REACCION DE BORNTRAGER

FRACCION C: Sobre esta fracción se realiza directamente los ensayos de:


• REACCION DE LIEBERMAN-BUCHARD
• REACCION PARA ALCALOIDES:
Reacción Mayer:
Reacción Hager:
Reacción Dragendorff:
Muestra seca y molida 20 gr

 Filtrar en caliente, llevar a 50 ml


 Macerar en etanol por 48 horas
Separar  Reflujar por 8 horas
10 ml

Fracción A Extracto Etanólico


 Secar a presión y T.
reducida

Taninos Fenoles Libres Extracto seco


R. Gelatina R. FeCl3

Solución Acida Insoluble

 Neutralizar con NaOH  Lavar con agua


 Extraer con diclorometano (2  Agregar
porciones) diclorometano
 Filtrar y llevar a 10 ml  Filtrar y llevar a 10
ml
Fracción B
Fase Diclorometanica Fase Acuosa
 Lavar, secar con
Triterpenos y esteroides Antraquinonas
sulfato de sodio
anhidro
R. liebermanBurchard Borntrager
 Llevar a 10 ml

Fracción C Fase Diclorometanica - Etanol Fase Acuosa Remanente


 Filtrar sobre sulfato
de sodio anhidro Fracción E
Alcaloides  Llevar a 10 ml
Triterpenos y
Flavonoides
esteroides R.  Dragendorff Fracción D
liebermanBurchard  Mayer R. Shinoda
 Wagner
 Hager
Alcaloides Triterpenos y Flavonoides
esteroides
Dragendorff R. Shinoda
R.
Mayer
liebermanBurchard
1.EXTRACTO ETANÓLICO
POR PERCOLACIÓN
Y/O LIXIVIACIÓN.

2.EXTRACTO ACUOSO
POR REFLUJO
Cepa utilizada :
 Escherichia coli (ATCC 25922).
 Sthapylococcus aureus (ATCC 25923)

Medios de Cultivo :
 Agar Müller-Hinton
 Caldo Nutritivo.

Control Positivo :
 Cloranfenicol

Control Negativo :
 Etanol 96º
 Agua destilada
Preparación del Medio de Cultivo Sólido

• Se suspende 39 g de medio de cultivo Mûeller –Hinton, en 1000 ml. de agua destilada, y


se calienta a ebullición hasta disolución completa. Se distribuye en frascos y se esteriliza
en autoclave por 15 minutos y 15 lb de presión (121ºC).

Preparación del Medio de Cultivo Líquido

• Se suspendió la cantidad requerida de cultivo (polvo en gramos por litro de agua destilada
. Luego se mezcló hasta uniformar. Se calentó agitando frecuentemente unos minutos
hasta que se disolvió y se llevó a autoclave entre 15 a 20 minutos a 121° c 0 15 lb de
presión. Luego se distribuyó en placas o en tubos.

Preparación del Inóculo.-

• De un cultivo puro se tomó una asada de 4 a 5 colonias que presentaron las mismas características
morfológicas.
• Luego fueron sembradas en caldo nutritivo para bacterias.
• Seguidamente fueron incubados a 37 ºC por 24 horas, para determinar aproximadamente la
concentración microbiana estos caldos fueron ajustados a la turbidez del estándar Nº 0.5 de Mac
Farland.
• Método de Difusión en Agar
AL DISCO
100 µL.

Los Discos fueron embebidos La Pinza fue esterilizada


con 100 mL. de las distintas luego de cada siembra
concentraciones de los extractos Estos fueron ubicados sometiéndolo a flama al
de forma equidistante rojo vivo
en el medio cultivado
50 mg
Extracto A

25 mg 100 mg
Extracto A Extracto A

50 mg
Extracto B

25 mg 100 mg
Extracto B Extracto B

Medición de los Halos de


Distribución de los Discos con Inhibición en unidad de medida
milímetro
Figura N º19: Placa petri de antibiograma con discos
embebidos con el extracto acuoso por reflujo. Muestra los
halos de inhibición: disco Nº 7 un halo de inhibición de
15.6 mm. En el centro C esta en el control positivo.
PIR (%)= A X 100
B
Donde:
A= Promedio del diámetro del halo de
inhibición del extracto.
B= Promedio del diámetro del halo de
inhibición del antibiótico.
CAPITULO III :
RESULTADOS
FRACCION METABOLITO REACCIONES RESULTADO OBSERVACIONES

A Taninos Solución de ++ Turbidez


Gelatina 0.5%
A Grupos fenólicos Solución de +++ Verde oscuro
libres Cloruro férrico
B Triterpenos y Liebermann- +++ Verde oscuro
Esteroides Burchard
B Antraquinonas Borntrager ++ Coloración roja

C Triterpenos y Lieberman- ++ Verde oscuro


Esteroides Burchard
C Alcaloides Mayer + Precipitado
Hager + Precipitado
Dragendorff + Precipitado
D Triterpenos y Liebermann- - -----------
Esteroides Burchard
D Alcaloides Mayer ++ Precipitado
Hager ++ Precipitado
Dragendorff ++ Precipitado
D Leucoantocianidi Rosemheim - ------------
nas y catequinas
D Flavonoides Shinoda +++ Coloración rosada
E Leucoantocianidi Rosenheim - -------------
nas y catequinas

E Flavonoides Shinoda +++ Coloración rosada


F Saponinas Prueba de ++ Forma espuma
espuma
Diámetro (mm) de zona Control PIR%
de Inhibiciòn a diferentes
Microorganismos Extractos cc (mg/ml) (+) 250

100% 50% 25% mg/ml

Staphylococcus Etanólico - Percolación 7.2 7.0 6.9 27 25.55 C.P. = Cloranfenicol


25mg/mL
aureus
C.N.= Alcohol de 96º y
agua destilada
Acuoso - Reflujo 15.6 15.2 15.1 27 55.92
PIR = Porcentaje de
Inhibición Relativa.

Escherichia coli Etanólico- Percolación. 6.5 6.2 6.1 21 29.04

Acuoso – Reflujo - - - 21 -
Microorganismos Extractos Concentración decreciente de extractos mg/mL.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentración 250 125 62.5 31.25 15.6 7.8 3.9 2.0 1.0 CN

mg/Ml (25%)

Staphylococcus Acuoso x Reflujo - - - - - + + + + +

aureus
Etanólico - - - + + + + + + +
Percolación

Acuoso x Reflujo + + + + + + + + + +

Escherichia coli
+ + + + + + + + + +
Etanólico
Percolación
CMI: mg/mL.

Extractos

Microorganismo

Acuoso x reflujo Etanólico percolación

Staphylococcus aureus 15.6 62.5


• El Schinus molle L. es una especie originaria de la región andina peruana, y actualmente se
distribuye en Argentina, sureste de Brasil, Perú, Colombia, Ecuador, Uruguay, oeste de México,
Guatemala e Islas Canarias.

• En la medicina tradicional se emplea para afecciones respiratorias, reumatismo, procesos


inflamatorios, depurativo, cicicatrizante, hemostático, hepatitis, etc.

• En un trabajo anterior realizado por Gupta M. en 1995, determinó que las hojas tenían como
componentes químicos a los flavonoides, compuestos fenólicos, triterpenos y antraquinonas. Por
ello se consideró necesario realizarle un screening fitoquìmico, que permitió identificar a los:
taninos, grupos fenólicos, triterpenos y esteroides, antraquinonas, alcaloides, flavonoides y
saponinas.
• Estudios realizados por Anesini C, Pérez C, en 1993, demostraron que el extracto acuoso de las
hojas de Schinus molle L., no tienen actividad frente Staphylococcus aureus,Aspergillus nigery E.
coli. Mientras que en nuestro estudio, si se evidenció actividad antibacteriana frente a la cepa de S.
aureus, mientras que frente a la cepa de E. coli, no presentó actividad antibacteriana.
• La determinación de la actividad antibacteriana de los extractos acuoso y etanólico de las hojas, se
realizó por el Método de disco difusión a las concentraciones de 100, 50 y 25%, obteniéndose como
resultado halos de inhibición 15.6mm, 15.2mm y 15.1mm respectivamente, frente a
Staphylococcus aureus comparándolo con el control positivo de cloranfenicol, considerándose una
sensibilidad intermedia. El extracto etanólico a las concentraciones de 100, 50 y 25%, obtuvo halos
de inhibición de 7.2mm, 7.0mm y 6.9mm, al compararlo con el control positivo cloranfenicol, se
considera como resistente.
• Mientras que el extracto etanólico por percolación frente a Escherichia
coli, a las concentraciones de 100, 50 y 25%, presentó halos de inhibición
de 6.5 mm, 6.2mm y 6.1mm lo que según el control positivo cloranfenicol
se considera como resistente. El extracto acuoso por reflujo frente a
Escherichia coli no presentó halos de inhibición en las concentraciones
mencionadas.
• La ausencia de actividad inhibitoria del extracto acuoso de Schinusmolle L.
frente a Escherichia coli, comparado a lo observado con Staphyllococcus
aureus, se relaciona con las diferencias estructurales en dichas bacterias
representantes tanto de bacterias Gram negativas como bacterias Gram
positivas respectivamente, donde las Gram negativas presentan una
envoltura externa que protege a la pared bacteriana (que es mas angosta)
mientras que en las Gram positivas no se presenta dicha envoltura
estando más expuesta la pared bacteriana (más ancha o gruesa) donde
posiblemente actuaria el extracto evaluado, desestabilizando la pared
bacteriana.
• En lo referente a la Concentración mínima inhibitoria(CMI), a una
concentración de 250mg/mL (25%) para el extracto acuoso por reflujo se
puede observar el efecto inhibitorio a una concentración de 15.6 y para el
extracto etanólico por percolación se observó a una concentración de
62.5mg/mL.
• Los metabolitos secundarios presentes en los extractos de
las hojas de Schinus molle L. fueron : taninos, grupos
fenólicos, triterpenos y esteroides, antraquinonas,
alcaloides, flavonoides y saponinas. Falta
• La actividad antibacteriana de los extractos acuoso y
etanólico de las hojas de Schinus molle L. a una
concentración de 250 mg/mL, frente a Staphylococcus
aureus, mostró halos de inhibición de 15.1 mm y 6.9 mm
respectivamente
• El extracto etanólico por percolación, frente a Escherichia
coli, presentó un halo de inhibición de 6.1 mm, mientras
que el extracto acuoso por reflujo no presentaron halos de
inhibición.
• La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) a una
concentración de 250mg/mL. para los extractos
acuoso por reflujo fue de 15.6mg/mL. y para el
extracto etanólico por percolación se observó a
una concentración de 62.5mg/mL..
• El porcentaje de inhibición relativa (PIR) frente a
Staphylococcus aureus, para el extracto acuoso
por reflujo fue de 55.92 %, mientras que el
extracto etanólico por percolación obtuvo un
25.55%. El PIR para el extracto etanólico por
percolación frente a Escherichia coli fue de
29.04%.
• Probar a la actividad antibacteriana de los
extractos de las hojas de Schinus molle L., frente
a otros microorganismos .
• Realizar estudios pre-clínicos para comprobar
otras actividades farmacológicas.
• Incentivar a los estudiantes de la Farmacia y
bioquímica a investigar plantas de nuestra región.
• Continuar con estudios de otras propiedades
terapéuticas de Shinus molle L.