DETERMINACION

FLUORIMETRICADE
QUININA EN
TONICA

Pablo Fernández López

¿QUE ES LA FLUORESCENCIA?
 FLUORESCENCIA:

Absorción molecular de un fotón

Emisión una luminiscencia a mayor l

Salto de Stokes

Toma su nombre de la fluorita

 FACTORES ESTRUCTURALES

Extensión del sistema de electrones p

Rigidez estructural

Impedimentos estéricos

Efecto de átomo pesado interno

Naturaleza de la transición
Formación de complejos organometálicos
Efectos de los sustituyentes
Extensión del sistema de electrones p
Rigidez estructural
 Impedimentos estéricos

cis 1,2-difenileteno trans 1,2-difenileteno

Efecto de átomo pesado interno
FLUORESCENCIA
F
RELATIVA

100%

Cl

7%

Br

0.2%

<0.05%
 Naturaleza de la transición fluorescente

p-p*
Absortividad molar alta
Velocidad de fluorescencia elevada

n-p*
Absortividad molar baja
Velocidad de fluorescencia pequeña
 Formación de complejos organometálicos

Cambio en la naturaleza de la transición

n-p* p-p*
-Análisis de metales
-Análisis de ligandos poco fluorescentes

Favorecer el cruzamiento entre sistemas

 Efectos de los sustityentes

Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y -OR

aumentan la eficacia de la fluorescencia,desplazándola a mayores l.

Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y –NO2,reducen

la eficacia de la fluorescencia al introducir una transición n-p *.

Los halógenos producen efecto de átomo pesado interno

Los grupos sulfónicos no modifican significativamente la fluorescencia

 Polaridad
Temperatura Viscosidad

FACTORES DEL MEDIO pH

Atomo pesado externo Puentes de hidrógeno

Otros solutos: atenuación de la fluorescencia

 800

600
Intensidad de fluorescencia

Ia
400

Is

200

K
0
280 320 360
Longitud de onda excitación (nm)
Fluorescencia de la orina
Fluorescencia del suero sanguíneo
Fluorescencia de la leche de vaca
ANALISIS CUALITATIVO
 IDENTIFICACION EN EL
ESPECTRO DE LAS DIFERENTES
BANDAS Y PICOS
 Fluorescencia de la quinina
Fluorescencia

emisión
excitación

Longitud de onda (nm)

 Fluorescencia de la quinina

excitación
Fluorescencia

emisión

Longitud de onda (nm)

 Fluorescencia de la quinina

excitación
Fluorescencia

emisión

Longitud de onda (nm)

 Fluorescencia de la quinina

excitación
Fluorescencia

emisión

Longitud de onda (nm)

 Fluorescencia de la quinina

excitación
Fluorescencia

emisión

Longitud de onda (nm)

 Fluorescencia de la quinina

excitación
Fluorescencia

emisión

Longitud de onda (nm)

 Fluorescencia de la quinina

Máximo de excitación Máximo de emisión

Fluorescencia

excitación
emisión

Longitud de onda (nm)

 Fluorescencia de la quinina

excitación emisión
Fluorescencia

¿Esto ¿Esto
que es? que es?

Longitud de onda (nm)

ESPECTRO DE EXCITACION SIN SELECCIONAR lem.
La dispersión ocurre a todas las longitudes de onda.

5
INTENSIDAD

200 250 300 350 400 450 500

LONGITUD DE ONDA (nm)
ESPECTRO DE EXCITACION A lem = 450 nm
Resulta un pico de luz dispersa proveniente de la lámpara a
lex = lem = 450 nm.

5
INTENSIDAD

2 Pico Rayleigh
450 nm
1

200 250 300 350 400 450 500

LONGITUD DE ONDA (nm)
ESPECTROS ANTERIORES SUPERPUESTOS
7

5
INTENSIDAD

450 nm
1

200 250 300 350 400 450 500

LONGITUD DE ONDA (nm)
ESPECTRO DE EXCITACION A lem = 450 nm.
RENDIJAS A 16 nm RENDIJAS A 2nm

ANCHURA DEL RAYLEIGH SEGUN RENDIJA

7

5
INTENSIDAD

2
Pico Rayleigh
450 nm
1

200 250 300 350 400 450 500

LONGITUD DE ONDA (nm)
 ESPECTROS DE EXCITACION A DOS lem
RENDIJAS A 16 nm RENDIJAS A 2nm

POSICION DEL RAYLEIGH RESPECTO AL ESPECTRO

7 7

6 6

5 5

INTENSIDAD (nm)
INTENSIDAD

4 4

3 3

2 2

480 nm
1 450 nm 1

0 0

200 250 300 350 400 450 500 300 350 400 450 500 550 600
LONGITUD DE ONDA (nm) LONGITUD DE ONDA (nm)
COMPARACION DE ESPECTROS
 7

6
PATRON DE QUININA

5
INTENSIDAD (nm)

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 7

5
INTENSIDAD (nm)

DISOLUCION DE TONICA
3

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 NORMALIZACION DE ESPECTROS

6
PATRON DE QUININA

5
INTENSIDAD (nm)

DISOLUCION DE TONICA
3

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 NORMALIZACION DE ESPECTROS

7 7

6 6
PATRON DE QUININA PATRON DE QUININA

5 5
INTENSIDAD (nm)

INTENSIDAD (nm)
4 4
DISOLUCION DE TONICA
DISOLUCION DE TONICA NORMALIZADO AL
3 3 PATRON DE QUININA

2 2

1 1

0 0

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm) LONGITUD DE ONDA (nm)
ANALISIS CUANTITATIVO
 7

5
INTENSIDAD (nm)

100 ppb
2

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 7

5
INTENSIDAD (nm)

3
200 ppb
100 ppb
2

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 7

5
INTENSIDAD (nm)

3 300 ppb
200 ppb
100 ppb
2

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 7

5
INTENSIDAD (nm)

400 ppb
3 300 ppb
200 ppb
100 ppb
2

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 7

5
INTENSIDAD (nm)

500 ppb
400 ppb
3 300 ppb
200 ppb
100 ppb
2

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 7

5
INTENSIDAD (nm)

4 TONICA
500 ppb
400 ppb
3 300 ppb
200 ppb
100 ppb
2

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 7

lex = 350, lem = 450 nm

6

5
INTENSIDAD (nm)

4 TONICA
500 ppb
400 ppb
3 300 ppb
200 ppb
100 ppb
2

375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
 7.0

Ajuste linear, y=b*x + a

[Quinina] Fluorescencia 6.5
Y = 0.01163 * X + 0.0150002
(ppb) 6.0 Coeficiente de la determinación r^2 = 0.9977
5.5

100 1.19 5.0

4.5

FLUORESCENCIA
200 2.38 4.0

3.5

300 3.49 3.0

2.5

400 4.53 2.0

1.5

500 5.93 1.0

0.5

tónica 3.77 0.0

0 100 200 300 400 500 600

CONCENTRACION (ppb)
 PRÁCTICA Nº 1
DETERMINACIÓN ESPECTROFLUORIMÉTRICA DE
QUININA EN AGUA TÓNICA
PROCEDIMIENTO

1.- Preparar disoluciones de 100, 200, 300, 400 y 500 ppb a partir de una disolución de sulfato de quinina de
2.5 ppm y enrasar a 25 ml con H2SO4 0.1 N.
2.- Registrar los espectros de excitación y emisión de una de las muestras y medir la intensidad de
fluorescencia a 350 nm de excitación y 450 nm de emisión de todas ellas para construir la recta de
calibrado.
3.- Pasar el contenido de un agua tónica a un vaso de precipitado y agitar vigorosamente a temperatura
ambiente durante 10 minutos.
4.- Tomar 1.0 ml y añadir la cantidad necesaria de H2SO4 concentrado (36 N) para que en un volumen final
de 250 ml sea 0.1 N.
5.- Registrar los espectros de excitación y emisión, comprobando que en estas condiciones la fluorescencia
del agua tónica es debida únicamente a la quinina.
6.- Medir la fluorescencia a 350 nm de excitación y 450 nm de emisión calculando la concentración de
quinina en el agua tónica a partir de la recta de calibrado.

MATERIALES PRODUCTOS
- Espectrofluorímetro - Agua tónica
- Matraces de 25 ml. - H2SO4
- Pipetas graduadas. - Bisulfato de quinina
- Vaso precipitado.
- Agitador magnético con núcleo.
 PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO

1. Componentes principales de un espectrofluorímetro. Función

principal de cada uno de ellos.

2. En los espectros que se han dado en la práctica se muestra el

espectro de excitación y de emisión de fluorescencia de quinina.
Comentarlos brevemente, es decir:
a) Identificar cada uno de los espectros
b) Localización de los máximos. Número de bandas que presenta cada
espectro
c) Señalar los máximos de intensidad. ¿Conviene realizar el calibrado
a dichos máximos? ¿Por qué?
d) Encontramos alguna simetría entre ambos espectros. ¿Por qué?
e) En excitación encontramos más de una banda de fluorescencia. Si
se pretende evitar interferencia en la medida por parte de otras
sustancias que puedan estar presentes en la muestra, ¿Qué
banda se debería elegir para la determinación de quinina en
tónica?
 PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO

3. En espectrofotometría, los espectros son de excitación mientras

que en espectrofluorimetría estos son de emisión y de excitación, es
decir tridimensionales. Ventajas e inconvenientes (al menos 3)

4. ¿Coincide un espectro de excitación de fluorescencia con uno de

absorbancia (espectrofotometría)? ¿Por qué? Explicarlo en términos
de transiciones electrónicas.

5. ¿Cómo se relaciona la señal instrumental que se mide en

fluorescencia y en espectrofotometría respecto a la intensidad de la
radiación incidente? ¿Es ésta monocromática o policrómática?
Explique la respuesta

6. Dibuja un posible espectro de excitación de fluorescencia de la

clorofila sabiendo que absorbe en las regiones visibles del azul y del
amarillo. Dibuja igualmente su espectro de emisión fluorescente.
 PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO

7. Una muestra problema ofrece un espectro de absorbancia en el

que se observan tres máximos claramente definidos ¿Qué puede
deducirse al respecto?

8. La muestra anterior ofrece un espectro de emisión de

fluorescencia en el que se observan dos máximos claramente
definidos. ¿Qué puede deducir en este caso? Dibujar este espectro
y su correspondiente de excitación de fluorescencia (téngase
presente tanto los valores de longitud de onda como de intensidad).

9. Proponga una estrategia para detectar el pico de luz dispersa

(pico Rayleigh) en un espectro de emisión de fluorescencia.

10. Resultados obtenidos: recta de calibrado y concentración de

quinina en la tónica.
 ¿QUE ES LA QUININA?
La quinina, C20H24N2O2 es un alcaloide natural, blanco y cristalino, con
propiedades antipiréticas, antimalaria y analgésicas.
Fue el principal compuesto empleado en el tratamiento de la malaria ya
que resulta tóxico para el plasmodium, el parásito que infecta los
glóbulos rojos. Actualemente, ha sido sustituida por otros medicamentos
sintéticos más eficaces. Se puede utilizar todavía en el tratamiento de
la malaria resistente, los calambres nocturnos en las piernas y en la
artritis. Sin embargo, su usoa dosis terapéuticas puede provocar
cinchonismo; en dosis altas o casos raros, puede ser incluso letal,
debido a un edema pulmonar agudo y fulminante. El dosis muy elevadas
puede provocar aborto o defectos de nacimiento (especialmente
sordera) si es tomada por mujeres durante el embarazo.
La quinina se extrajo por primera vez de la corteza de la quina, un
árbol presente naturalmente en Sudamérica. Fue aislada y bautizada
así, en 1820, por los investigadores franceses Pelletier y Caventou.
La quinina se usa como potenciador del sabor en el agua tónica,
confiriéndole su característico sabor amargo. Debido a los efectos
secundarios de altas dosis de quinina, su concentración se ha limitado
por la FDA estadounidense a un máximo de 83 ppm. Este valor es
aproximadamente un cuarto del empleado terapéuticamente.
ESTRUCTURA MOLECULAR
 Quinina
Número CAS [130-95-0]
Fórmula química C20H24N2O2
Peso molecular 324.42
Propiedades físicas

Punto de fusión 177°C (descompone ligeramente)

Punto de sublimación 180°C (en alto vacío)

Densidad 1.293 g/cm3

1 gramo/1900 mL, pH de la disolución saturada: 8,8,

también soluble en etanol (1 g/0,8 mL), 4 g/l (éter
Solubilidad en agua
anhidro), benceno (1 g/80 mL), cloroformo (1 g/1,2
mL), glicerol (50 g/L)

Fluorescencia Azul, se intensifica en ácido sulfúrico