Evaluación de tres ensayos de diagnostico basados en PCR para la detección de infecciones mixtas de Plasmodium

González Silvia Deynali Patricia Olmos García Francisco Xavier Valdés Rives Silvia Anahi

Antecedentes y Descubrimientos

Antecedentes 

Aproximadamente 2 millones de personas están expuestas a la malaria con un estimado de 250 millones de casos clínicos y alrededor de 800.000 muertes al año 

Cuatro especies de Plasmodium se sabe que causan la malaria en humanos: P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale.

  Muchas regiones endémicas con malaria tienen informe de infecciones mixtas de estas especies y la prevalencia de infecciones mixtas varía según la región geográfica. en consecuencia muchas enfermedades febriles de etiología desconocida se atribuyen a la malaria (que resulta en el diagnóstico presuntivo y tratamiento) . Las presentaciones clínicas de la malaria son a menudo inespecíficas y.

existen varios desafíos en el desempeño del diagnóstico microscópico para el uso clínico de rutina. la microscopía se ha mantenido como el estándar para la detección de la malaria y la determinación de especies en áreas endémicas.  . Sin embargo. pruebas de diagnóstico rápido (PDR) y herramientas moleculares  Desde hace más de un siglo. Los instrumentos existentes para el diagnóstico de la malaria incluyen microscopía.

Las PDR se utilizan cada vez para el diagnóstico de la malaria debido a que son rápidos y fáciles de usar sobre todo en entornos de recursos limitados. Las PDR son pruebas inmunocromatográficas diseñadas para detectar parásitos en los productos de la sangre humana.  .

la densidad de la parasitemia no puede determinarse con precisión. Debido a que las PDR son sólo pruebas cualitativas. .

además de la detección de infecciones subclínicas. . el uso de herramientas moleculares se ve obstaculizada por algunos factores. incluido el costo elevado de la colocación del equipamiento inicial y la imposibilidad de obtener reactivos debido a una infraestructura en entornos de muchos campos. Los métodos moleculares han demostrado ser útiles en la identificación de especies y la detección precisa de las infecciones de especies mixtas.  Sin embargo.

. La prueba más utilizada para el diagnóstico molecular de la malaria es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)-basada en la amplificación del ADN ribosomal 18S (ADNr) y del gen que permite la detección de las diferentes especies de parásitos de la malaria humana. basados en productos de diferentes tamaños de PCR.

malariae. incluso en una referencia de diagnóstico de laboratorio en los Estados Unidos.  El método de PCR anidada desarrollada por Snounou ha sido ampliamente utilizado en estudios de laboratorio y en el diagnóstico clínico. vivax. ovale y P. Sin embargo. P. P. . este método requiere mucho tiempo. falciparum. costoso y es laborioso. ya que requiere de cinco reacciones de PCR por separado para detectar P.

 El PCR multiplex semi. uno específico para el género Plasmodium y otro específico a todos los ADNr 18S de los mamíferos.anidada utiliza una imprimación universal 18S ADNr marcha atrás y dos hacia adelante cebadoras 18S rDNA. .

falciparum P. ovale 0. .004 p / l  Y no prueba de sensibilidad de la prueba para P. vivax y P.  Padley afirma la sensibilidad de que el ensayo sea de:   0. El múltiplex de una sola ronda utiliza un género Plasmodium primer específico inversa con cuatro especies con interés en cebadores específicos.02 p / l para P. malariae.

. Además de los tradicionales herramientas moleculares basados en PCR y PCR en tiempo real han demostrado recientemente ser una alternativa sólida para el diagnóstico de la malaria. la falta de infraestructura y falta de apoyo técnico debido a problemas de infraestructura. varios factores impiden el uso de este método en las regiones endémicas de malaria. incluido el costo.  Sin embargo.

Por lo que se han comparado en este artículo los dos métodos con el método multiplex anidada utilizando cantidades conocidas del laboratorio de ADN derivados Plasmodium solo y mixtos cócteles que contienen las cuatro especies de ADN. nadie ha evaluado que estos métodos de PCR tradicional es mejor en la detección de infecciones mixtas por Plasmodium. Sin embargo.     Métodos: Anidada Semi-anidada Un sólo tubo múltiple .   Los tres métodos descritos anteriormente basadas en la PCR son buenas alternativas a la microscopía y PDR.

Métodos .

malariae (Uganda) P. ovale (Nigeria) . vivax (SV4) P.Cultivo de Parásitos y extracción de ADN  ADN extraído de :     Cultivos P. Falciparum (3D7) Derivados de monos P.

 Para las cuatro especies:     Frotis delgados Tinciones Conteo Para conteo de glóbulos infectados El # total de glóbulos rojos por micro litro se determino para cada especie usando un Coulter counter  .

 ADN aislado:     Un total de 8x106 parásitos por especia Suspendido en 200µl estéril de TE Se tomaron alícuotas y se guardo a -20°c Diluciones hasta: 0.04 genomas/µ .

   Evaluación de limites de diagnóstico: Detecciones individuales Detección de múltiples especies 7 repeticiones Cocteles mixtos: 2µl de cada especie en dif. concentraciones   .

 Cocteles mixtos:     Bajos niveles de infección Variaciones en niveles Predominancia de parásitos Cantidad similar de parásitos es rara. .

Discusiones y Resultados .

Comparación de técnicas para el diagnóstico de diferentes especies de Plasmodium 1. Nested PCR Semi-nested multiplex One tube multiplex . 3. 2.

1.4 p/µl . Nested PCR  Especies de Plasmodium 0.

Malariae (0. Ovale ( 4 p/µl) Diferencia de sensibilidad ¾ especies   .4 p/µl) P. Semi-Nested PCR    P.2. falciparum y P.4 p/µl) P. Vivax (o.

. malariae y P. Vivax. falciparum en una mezcla. Multiplex PCR    Menos especificidad Al menos detecta 2 especies simultáneamente Detecta correctamente P.3. pero no a P.

 Identificación de P.  .Confiabilidad: Menos de 50% de las pruebas realizadas. Ovale si la concentración del DNA era igual o mayor que 10 p/ul.

y el multiplex PCR. Ovale en mezclas usando: el seminested PCR. De P. 1ro: 22/42 2do: 7/42 de las concentraciones esperadas para P.Con las pruebas detectaron:  1 p/µl. Vivax 9/42 Valoración : 7 replicaciones     .

Limitaciones .

Costos  Reactivos + plásticos consumidos (muestra) Nested PCR $8 dll/m Semi-nested PCR $5 dll/m Multiplex PCR $4 dll/m    .

Promoviendo la optimización de nuevas técnicas moleculares puede incrementar el éxito en las pruebas de PCR tradicionales.CONCLUSIONES  Se demostró que El Nested PCR method es la mejor prueba basada en PCR para la detección de diversas especies causantes de la malaria.  .

No con mezclas. El semi-nested arrojó mejores resultados si se trataba con muestras con una misma especie.  . para cualquier nivel de infección. Las técnicas moleculares como las estudiadas. son las más precisas.

Gracias ¿Preguntas? .

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