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TECNOLOGÍA ADN

RECOMBINANTE

ÓSCAR GALO
IRENE BERTRAND
APLICACIONES
- Producción de la hormona del crecimiento para uso
humano
APLICACIONES
- Cultivos resistentes a herbicidas (transgénicos)
PRINCIPIO BÁSICO
- “Cortar “y “pegar” fragmentos de ADN de un organismo a
otro, usando enzimas de restricción y ADN ligasa.
PRINCIPIO BÁSICO
AISLAMIENTO Y
PURIFICACIÓN DE ADN
- Existen diversas técnicas para aislar y purificar ADN,
dependiendo principalmente de el tipo de célula del cual
se extrae.
- En general, los pasos son:
1. Lisis celular
2. Eliminación de proteínas
3. Eliminación de ARN
4. Remoción de contaminantes
5. Precipitación del ADN
6. Redisolución del ADN
LISIS CELULAR
- Se debe romper la membrana celular para separar los
componentes extra nucleares del ADN
• Algunos métodos para lograr la lisis celular son:
- Ruptura mecánica (Lisis hipotónica):
Se utiliza un gradiente de electrolitos para
Provocar la ósmosis forzada en la célula

- Lisis enzimática:
Algunas enzimas pueden degradar los componentes de la
pared celular, como el peptidoglucano
ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS
- Al romperse la pared celular y centrifugarse, se tiene una
mezcla de proteínas, ADN y ARN separados del agua y
otros componentes celulares.
- Para eliminar las proteínas, se utilizan proteasas tales
como la proteinasa K o las pronasas.
ELIMINACIÓN DE ARN
- Este paso es muy necesario, debido a que si se desea
secuenciar el ADN, se puede crear confusión en las lecturas
debido a la presencia de bases nitrogenadas pertenecientes
al ARN.
- Para realizar esta función, se utilizan ribonucleasas, las
cuales degradan el ARN en sus ribonucleótidos.
Posteriormente, se añade alcohol a la solución para forzar
una precipitación diferencial y obtener dos fases: ADN +
agua/ribonucleótidos + alcohol
REMOCIÓN DE CONTAMINANTES
- Aún en solución se encuentran algunos contaminantes,
como alcohol, ribonucleótidos, proteínas (en menor
proporción).
- Estas moléculas son removidas mediante una extracción
líquido – líquido, aprovechando la polaridad del ADN
debido a sus grupos fosfato disolviendolo en agua e
introduciendo a la solución un disolvente orgánico como
el fenol o el cloroformo
PRECIPITACIÓN DEL ADN
Para este paso, se recomienda centrifugar la muestra libre de
contaminantes. Luego, adicionar etanol en presencia de altas
concentraciones de sales tales como el acetato de amonio,
acetato de sodio, o acetato de potasio (sales monovalentes),
las cuales permiten una precipitación del ADN al enlazarse
con los grupos fosfato
REDISOLUCIÓN DEL ADN
Finalmente, cuando el ADN está libre de contaminantes, se
diluye en una solución amortiguadora (EDTA 0.1 M), para
conservarlo ante cambios de pH a una temperatura
adecuada.