CROMATOGRAFÍA

Mikhail Tswett, 1906

Separación de pigmentos vegetales usando una
columna de carbonato cálcico
CROMATOGRAFÍA

Separación de los componentes

de una mezcla (muestra),
disueltos en una fase móvil a
medida que se van desplazando
con diferente velocidad a través
de una fase estacionaria
 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
FASE MÓVIL

Registrador
Solventes
(fase móvil)

Bomba(s)

COLUMNA
Detector
(UV)
Mezclador

Inyector
Colector de

MUESTRA fracciones

FASE ESTACIONARIA
 CROMATOGRAFÍA

Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido

Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la

fase estacionaria

Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de

manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto
entre ambas

Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas

α= [moléculas adsorbidas]
[mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]
coeficiente de reparto
 METODOLOGÍA ANALÍTICA EN EL ANÁLISIS DE TRAZAS

TENDENCIA EN COSTE
LIMITES DE DETECCIÓN, ppm (Aprox.)

BIOENSAYO, GRAVIMETRÍA
>1

TENDENCIA EN SELECTIVIDAD
COLORIMETRÍA, ESPECTROFOTOMETRÍA
0.1

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Y CAPA FINA

0.01

CROMATOGRAFÍA DE GASES Y LIQUIDOS

0.001

GC-MS Y HPLC-MS
<0.0001

1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000

AÑO (Aprox.)
 Alimentos: Directiva 90/642 CEE Aguas: Normativa Europea
de Aguas de Consumo
76/464/EEC
Tomate Pimiento Pepino
Abamectine 0.01 0.01 0.01
Benomyl 0.50 0.10 0.50
0.1 mg/l plaguicidas individuales
Cyromazin 0.50 2.00 0.10 0.5 mg/l plaguicidas totales
Dimetomorf 0.50 0.02 0.50
Ethiofencarb 2.00 2.00 2.00
Flufenoxuron 0.50 0.50 0.20 Lista negra de plaguicidas prioritarios
Hexaflumuron 0.05 0.50 0.05
Hexitiazox 0.05 0.50 0.10 Aldrin Disulfoton Monolinuron
Imidacloprid 0.10 0.50 0.10 Atracina Endosulfan Ometoato
Lufenuron 0.02 0.02 0.02 Azinfos-etil Endrin Oxidemeton-metil
Methomyl 1.00 1.00 0.02 Azinfos-metil Fenitrorion Paration-etil
Oxamyl 2.00 2.00 2.00 Clordane Fention Paration-metil
Teflubenzuron 0.50 0.50 0.20 Coumafos Hepatclor Foxim
Tiabendazole 0.10 1.00 1.00 2,4-D Hexaclorobenceno Propanil
Acrinathrin 0.10 0.20 0.02 DDT Linuron Pirazon
Bifenthrin 0.20 0.20 0.01 Demeton Malation Simazina
Buprofecin 0.50 0.50 0.20 Diclorprop MCPA 2,4,5-T
Chlorpyriphos-me 0.50 0.50 0.05 Diclorvos Mecoprop Triazofos
Endosulfan 1.00 1.00 1.00 Dieldrin Metamidofos Triclorfon
Malathion 3.00 3.00 3.00 Dimetoato Mevimfos Trifluralin
Methalaxyl 0.20 0.05 0.05
Methamidophos 0.50 0.01 1.00
 CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS

• Empleo de diferentes detectores

• Empleo de columnas de diferente polaridad
• Empleo de técnicas alternativas
• Técnicas de derivación

• Mayor coste
• Mayor tiempo de análisis
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

ESTADO FÍSICO DE LAS FASES:

Fase Móvil
- Gaseosa (Cromatografía de gases)
- Líquida (Cromatografía Líquida)

Fase Estacionaria
- Líquida (inmovilizada, soporte)
- Sólida
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

CRITERIOS DE SEPARACIÓN:

1. REPARTO (F. estacionaria “líquida”)

Los componentes de la mezcla se reparten entre las fases móvil
y estacionaria en función de sus características. La composición
de la fase móvil es constante.

2. ADSORCIÓN (F. estacionaria sólida)

Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre la
superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar la
composición de la fase móvil para eluirlos.
 CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

1.SOLUBILIDAD
Fase “Normal”: F. Estacionaria polar, F. Móvil apolar

Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Móvil polar

2. TAMAÑO (exclusión molecular)

Fases móvil y estacionaria líquidas idénticas
separadas por una especie de tamiz o malla
 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

1. INTERCAMBIO IÓNICO
Fase estacionaria positiva: Intercambio aniónico
Fase estacionaria negativa: Intercambio catiónico

2. INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
Fase estacionaria hidrofóbica

3. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD BIOLÓGICA

Fase estacionaria con ligandos inmovilizados

4. ADSORCIÓN INESPECÍFICA
hidroxiapatita, colorantes inmovilizados
 TIPOS DE CROMATOGRAFíA
Tipo de Tipo de cromatografía
interacción/reparto
Reparto Solubilidad •Fase Normal
•Fase Reversa
Tamaño •Exclusión Molecular

Interacción Electrostática •Intercambio aniónico

•Intercambio catiónico
Hidrofóbica

Afinidad biológica •Ligandos inmovilizados

•Inmunoafinidad
Afinidad inespecífica •Hidroxiapatita
•Colorantes
 FORMATO

1. COLUMNA 2. “BATCH” o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS

- Sistemas manuales - Papel
- Equipos automatizados - Capa fina
(HPLC) (TLC, thin layer chromatography)
 TERMINOLOGÍA

• FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico) componente

estático de la cromatografía

• FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la columna

los componentes de la mezcla a analizar

• ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta lograr la

salida de los solutos

• ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna

 TERMINOLOGÍA

• CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de elución.

Representación gráfica de la cuantificación de solutos en el eluído de
una columna

• VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa a través de la

columna hasta que sale cada soluto

• VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una molécula que viaja a

través de la columna con la velocidad de la fase móvil, que no
experimenta ningún retraso. También se llama VOLUMEN DE
EXCLUSIÓN
 FASE MÓVIL

FASE
ESTACIONARIA
Clasificaciones de cromatografía

1. Según como se encuentre la fase estacionaria

a. columna

b. batch

c. plana cromatografía en papel y en capa fina

2. Según el tipo de fase estacionaria y fase móvil

Fase estacionaria Fase móvil

Sólida Líquida o gaseosa

Líquido adsorbido Líquida o gaseosa

3. Según el tipo de flujo empleado

a. Gravedad

b. Capilaridad (papel, capa fina)

c. Fluído a presión (HPLC)

HPLC (high performance liquid chromatography)

Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión

Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad

El material empacado en las columnas está formado por pequeñas

partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez

Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión

Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable

o vidrio grueso
 HPLC:
High Performance Liquid Chromatography
Waters, Millipore
Perceptive BioSystems, BioCAD
FPLC (fast protein liquid chromatography)

Es una variante del HPLC con columnas y

equipamiento especialmente diseñado para
separar o purificar proteínas

Las columnas de FPLC soportan menos

presión que las de HPLC
4. Según la finalidad del experimento

Separación y purificación Preparativa

Separación, cuantificación y Analítica

caracterización
5. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto

a. Cromatografía de intercambio iónico carga-carga

b. Cromatografía de interacción hidrofóbica efecto hidrofóbico

c. Cromatografía de afinidad variada pero específica

d. Cromatografía de afinidad por metales enlaces covalentes

inmovilizados (IMAC)

e. Cromatografía de fase normal y reversa dipolos

Cromatografía de intercambio iónico

La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado

Las interacciones son electrostáticas

Dos tipos

Intercambio aniónico: matriz cargada

positivamente (DEAE, TEA, QAE)

Intercambio catiónico: matriz cargada

negativamente (carboximetilos,
sulfonatos, fosfatos)

Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o

ambos
 INTERCAMBIADORES IÓNICOS

+
carga aniónico aniónico
débil fuerte
(DEAE) (QAE)

pH
catiónico catiónico
fuerte débil
(SP) (CM)
-
 Condiciones iniciales Aplicación de la muestra
- -
+ + - -
+ + + - + + + -
+ +
- - + + + - + + + -
- - - -
- -
-
+ -
+ + + -
+
- + + + -
- -
-
- -
+ + - -
+ + + - + + + -
+ +
- - + + + - + + + -
- - - -
- -
-
+ -
+ + + -
+
- + + + -
- -
-
- -
+ - -
+ + + - +
+ + + - +
- - + + + - +
- - - + + + -
- -
-
Aumento en la concentración de sales Elución de la proteína de interés
- - - -
+ + + +
+ + + - + + + - + + + - + + + -
- - -
- - - -

- -
+ - +
+ + + + + + -
- -
- -

- - -
+ + + +
+ + - + ++ + - + + + - + + + -
- - -
- - - -

- -
+ +
+ + + - + + + -
- -
- -
- - -
-
+ +
+ + + - + + + + - +
+ + + -
- + + + - - -
- - - -
-
Cromatografía de afinidad

Se basa en una interacción biológica específica:

Enzima-sustrato

Anticuerpo-antígeno

Enzima-coenzima

Proteína-ligando específico

La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la

columna) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces
de debilitar la interacción
IMAC (immobilized metal affinity chromatography)

Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones

metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas (histidinas)

Principalmente a los iones divalentes de metales de transición

como Fe, Co, Ni, Cu y Zn

La elución se lleva a cabo adicionando quelantes más fuertes como el

imidazol a distintas concentraciones o cambios en el pH
Cromatografía de interacción hidrofóbica

El soporte está sustituído con cadenas alifáticas de 2 a 10 carbonos u otros

grupos hidrofóbicos

La interacción es de tipo hidrofóbica

La fase móvil debe tener una alta concentración de sales

((NH4)2SO3 2 – 4 M)

Salting out

Para la elución se disminuye la concentración de sales en la fase móvil

 Cromatografía de fase reversa

Está muy relacionada con la cromatografía de interacción hidrofóbica

pero son diferentes

El soporte está sustituído por alifáticas pero más largas (8 -18 carbonos) y
la densidad de sustituyentes es mayor

La unión es más fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no

polares para la elución

Desnaturaliza proteínas

Se utiliza en HPLC
Gel filtración (cromatografía de exclusión molecular)

No es una cromatografía

La separación se da por tamaño

El gel debe ser inerte, de tamaño de poro definido y sin carga

Múltiples aplicaciones:

Cambios de buffer

Separación de moléculas de bajo peso molecular de otras de mayor

tamaño

Determinación del peso molecular

Resultado final: cromatograma

y y

Velución (mL) Velución (mL)

y = unidades de absorbancia, unidades de fluorescencia relativa, intensidad

del pico (espectrometría de masa), entre otras