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BIOTECNOLOGÍA

INGENIERÍA
GENÉTICA
Biotecnología: Conjunto de técnicas que utilizan las potencialidades de
los organismos vivos o de compuestos procedentes de ellos (enzimas,
hormonas, antibióticos ….), para la obtención de productos, bienes y
servicios

Biotecnología tradicional:
procesos de fermentación
de bacterias y levaduras Biotecnología moderna: en los últimos
desde hace miles de años 30 años, avances en microbiología,
inmunología e ingeniería genética, con
manipulación selectiva y programada de
material genético

Biotecnología contemporánea
Clonación, nanotecnología,
biomateriales, reprogramación
APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA
APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA

ROJA - Aplicaciones médicas


• Obtención de nuevos productos y fármacos por organismos
• Producción de Ac monoclonales
• Desarrollo de terapias génicas y celulares

VERDE – Aplicaciones agrícolas y ganaderas


• Desarrollo de cereales resistentes a plagas
• Desarrollo de animales resistentes a enfermedades
• Desarrollo de plantas que expresen pesticidas

AZUL – Aplicaciones acuáticas y marinas


• Uso de plantas y productos marinos para obtener nuevos fármacos
• Restauración y preservación de especies acuáticas
• Uso de genes de organismos acuáticos para obtener resistencias

BLANCA – Aplicaciones a procesos industriales


• Producción de nuevos compuestos
• Desarrollo de combustibles nuevos
• Uso de bacterias para eliminar vertidos de petróleo
ORGANISMOS TRANSGÉNICOS

Organismo transgénico: es aquél que ha sufrido la alteración de su material


hereditario (genoma) por la introducción artificial (manipulación genética) de un
gen exógeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente.

Aparentemente no existen barreras para mezclar los genes (DNA) de dos


especies diferentes. Existen bioherramientas moleculares para componer y
descomponer al DNA, intercambiando así fragmentos específicos de ADN de
distintas especies e incluso transferirlos a bacterias.

Se descubrió posteriormente que esta práctica se venía haciendo en la


naturaleza de forma espontánea desde hace millones de años en los
vegetales a través de la bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens.

Las bacterias producen hoy en día, proteínas humanas por ingeniería genética
como el interferón, la insulina y la hormona del crecimiento, de gran
importancia en la medicina.
ORGANISMOS TRANSGÉNICOS

Microorganismos transgénicos
Producción de alimentos
Eliminación de basuras
Obtención de materias primas para la industria
Descontaminar lo que las industrias han contaminado

Animales de granja
(cerdos, ovejas, borregos)
"biorreactores“ de proteínas terapéuticas humanas en
su leche (antitripsina, factor VIII de coagulación…)

Plantas transgénicas "nueva revolución verde“


Resistentes a sequías, a herbicidas o a plagas de insectos,
Maduración tardía o con características para mantener el color y
sabor después de congelación
Ejemplos : algodón, la soja, la papa, el tomate y al maíz
INGENIERÍA GENÉTICA

La Ingeniería Genética
Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten
manipular el genoma de un ser vivo, introduciendo genes en un organismo
que carece de ellos

Se realiza por

Incluye
Enzimas de restricción
Capaces de cortar el ADN por puntos
concretos
Técnicas biotecnológicas
•Recombinación de ADN
•Secuenciación del ADN
Se obtiene •Reacción en cadena de la polimerasa
•Aplicaciones diversas

ADN Recombinante
Segmento de ADN extraño intercalado
en un ADN receptor
Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética

Entre los años 70 y 80 se desarrollaron


herramientas de la biología molecular y la
ingeniería genética, lo que se conoce
como técnicas del ADN recombinante

La técnica se fundamenta en:


•Doble cadena del ADN
•Complementareidad de bases
•Siempre que se encuentren
secuencias complementarias se unen
•Orden de las bases determina
información de proteínas
•Código de transcripción universal
Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética

La tecnología del ADN recombinante incluye diferentes


técnicas de las que destacan:
• La rotura específica del ADN mediante endonucleasas de restricción, que
facilita el aislamiento y la manipulación de los genes individuales.
• La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado
de ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de
aminoácidos que codifica.
•La hibridación de los ácidos nucléicos que hace posible localizar secuencias
determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas
moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucléicos.
• La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento
de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o virus)
que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de ADN
puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idénticas.
• La ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN
produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar
a células u organismos.
Enzimas: Endonucleasas de restricción

Endonucleasas de
Restricción:
Enzimas que pueden cortar el
ADN y lo hacen en secuencias
concretas

Enzimas que las bacterias usan


para destruir ADN que ingresa a
ellas, por ejemplo ADN de virus
bacteriófagos
Enzimas: Endonucleasas de restricción

Se conocen mas de 1200


enzimas de restricción

Eco RI (E. coli) reconoce


secuencias GAATTC y
corta entre G y A
Construcción de ADN recombinante

1 ADN plásmido

2 ADN extraño

3 Corte del plásmido y ADN


extraño con Eco RI
(endonucleasa de restricción)

4 Formación de
extremos cohesivos

5 Formación de ADN
recombinantes

6 Acción de ADN ligasa


que sella los extremos
Construcción de ADN recombinante
Clonación del ADN

La clonación de un gen consiste en introducirlo en una célula de modo que se


copie y se mantenga

El gen se inserta en un ADN llamado vector de clonación (plásmidos),


capaz de entrar y replicarse de forma independiente en una célula huésped

Resultado: ADN recombinante. Permite obtener grandes cantidades del gen


insertado en la célula hospedadora adecuada apropiada

Las genotecas de ADN permiten guardar indefinidamente el ADN de un


organismo

Un plásmido recombinante en una bacteria se replica con ella pudiendo


obtenerse y aislarse millones de copias de dicho plásmido
Clonación del ADN
Proceso de clonación de un gen en bacterias

1. Obtención de plásmido
recombinante

2. Transformación de
bacterias

3. Selección de bacterias
transformadas

4. Crecimiento de bacterias
transformadas

5. Aislamiento de los
plásmidos recombinantes
Clonación del ADN

Prácticas de ejercicios similares en la página indicada

Ejercicios:
http://personales.ya.com/geopal/biologia_2b
/unidades/ejercicios/act8abiointema6.htm
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica que permite


amplificar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de
pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN.

Es un método alternativo a la clonación muy rápido y eficaz

Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un


solo cabello, una célula somática o un espermatozoide.

Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de


personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de
muestras del niño y de su abuela materna

Aplicaciones médicas de la PCR en nuevas estrategias de diagnóstico:


Detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C
Regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)
Diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres
seropositivas.
Diagnóstico de hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, o
reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológ icas
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

El método se basa, en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas


a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente
entre veinte y cuarenta veces

Primer paso: La muestra se calienta hasta lograr la separación de las dos


cadenas que constituyen el ADN, "desnaturalización".

Segundo paso: la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de


cada una de dos cadenas cortas de oligonucleótidos (inicidores o primers)
con cada una de las hebras separadas del ADN molde.
Los “primers” son sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal
que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar

Tercer paso: la ADN polimerasa produce la “extensión” de los primers, en el


espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias
complementarias de las hebras del ADN molde (la Tª la condiciona la
polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

ADN polimerasa de E. coli


se desactiva a la alta
temperatura de la
desnaturalización del ADN,
por lo cual debía
agregarse enzima fresca al
comenzar el tercer paso
de cada ciclo.
Este inconveniente fue
solucionado de manera
ingeniosa cuando se la
reemplazó por su
equivalente de la bacteria
"termófila" Thermus
aquaticus

http://www.youtube.com/watch?v=N6
kBo_pTOA8
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

APLICACIÓN: amplificar ADN


•Fragmentos de ADN antiguos (momias,
fósiles..)
•ADN de la escena de un crimen
•ADN de células embrionarias para
diagnóstico prenatal
•ADN de genes virales
SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Sanger

•Métodos y técnicas para determinar el orden de los nucleótidos de un


determinado fragmento de ADN
•Utilidad importante en biología básica y aplicada (forense…)
•Precisa gran cantidad del fragmento a determinar (clonación)

Método Sanger o didesoxi:


•Fragmento de ADN (cantidad)
•Cebador en el extremo 3´ (20 bases)
•ADN polimerasa
•Desoxiribonucleótidos (A,T,C,G)
•Didesoxiribonucleótidos marcados
radiactivamente (paran la síntesis)

Cuatro tubos diferentes con:


Polimerasa
dATP, dCTP, dTTP y dGTP
Un solo didesoxi marcado
(ddATP)
Se forman fragmentos de distinto
tamaño terminados en A
SECUENCIACIÓN DEL ADN

Los fragmentos de ADN obtenidos se separan por tamaños con electroforesis


Cada una de las cuatro muestras se insertan en un carril diferente del gel
Terminada la electroforesis se ponen en contacto con una película fotográfica
SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Automático

Marcaje de ddNTP con fluorescentes distintos puediendose leer al mismo


tiempo losADNs de las cuatro mezclas

Comparativa de los dos


métodos
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente

•Tradicionalmente se han mejorado los cultivos por selección de ejemplares


•Actualmente se mejoran características con técnicas de ADN recombinante:
-Plantas transgénicas-

El plásmido Ti o T-ADN
de Agrobacterium
contiene genes (onc) que
provocan una mayor
producción de hormonas
de crecimiento con la
formación del tumor o
agalla.

Se eliminan de Ti los genes onc y se sustituyen por otros genes que interese
clonar, se habrá obtenido un sistema eficaz para introducir ADN interesante a la
planta, evitando la aparición de la enfermedad
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente

Actualmente se consiguen mejorar diferentes características con técnicas de


ADN recombinante -Plantas transgénicas-

•Resistencia a herbicidas
(mejora vegetal)
•Resistencia al glifosfato herbicida
no selectivo, con gen de E. coli
resistente, clonado e incorporado
•Resistencia a plagas, con toxina de
Bacillus turingiensis
•Resistencia a virus, con proteínas
de la cápsida de dicho virus

FASES:

1. Transferencia
de genes

2. Regeneración
de plantas
completas
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente

•Mejora del producto (alimentos)


•Arroz transgénico –arroz dorado- con
βcaroteno (vit A)

•Plantas farmaceúticas
(biofarmaceútica)
•Producción de proteínas humanas,
vacunas, anticuerpos, mas económicas y
contienen mecanismos de modificación
postraduccional de las proteínas, a
diferencia de las bacterias
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente

•Medio Ambiente:Utilización de organismos genéticamente modificados para eliminar contaminantes

Biorremedación: bacterias modificadas para degradar hidrocarburos

Bioadsorción: Bacterias modificadas que


adsorben en su superficie metales pesados
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente

Fitorremedación: Plantas transgénicas que transforman contaminantes


peligrosos en sustancias inocuas

chopos modificados para acumular metales,


actualmente en condiciones controladas en
invernadero

La fitoestabilización :plantas que inmovilizan los


metales en el suelo por absorción o adsorción en las
raíces. Los contaminantes permanecen retenidos bajo
la superficie del suelo

La fitoextracción : plantas tolerantes capaces de


absorber los metales desde el suelo y acumularlos en su
biomasa aérea. Posteriormente, esta biomasa es
cosechada, incinerada y tratada como residuo peligroso
INGENIERÍA GENÉTICA y GANADERÍA
•Inserción de genes en óvulos o células madre embrionarias:
Quimeras transgénicas Organismos transgénicos
sólo sobre algunas todas las células
células del embrión modificadas

Células modificadas Células no modificadas Transmisión a la descendencia,


órganos y tejidos para trasplantes

1.Secuencia hibrida de gen de


interés y secuencia promotora
de una proteína de la leche

2. Introducir el transgén en
óvulo fecundado
3.Implantación en la hembra
que lo expresará junto con la
leche

Ejs.: α1-antitripsina, factor VIII,…


INGENIERÍA GENÉTICA y MEDICINA

APLICACIONES

Obtención de productos
Medicina forense
farmacéuticos
Marcadores
Insulina genéticos
Interferón Huella genética
H. De crecimiento
Factor VIII
Terapia génica
Diagnóstico de Inserción de genes
enfermedades funcionales para corregir
Detección en personas o un defecto genético
fetos enfermedades
hereditarias por técnicas En células germinales
de ADN recombinante
En células somáticas
Producción de insulina humana
La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), que están
codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener
en cultivos bacterianos separados.
Proteína de fusión con subunidad A
Promotor del gen de la insulina

Subunidad A del
gen de la insulina
Transformación Extracción de Separación de
en E. coli las proteínas de los polipéptidos
fusión AyB
Promotor

Formación
Proteína de fusión
de insulina
con subunidad B del
Subunidad B del activa
gen de la insulina
gen de la insulina
CONSTRUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE