LA DEFICIENCIA DE ATP6V1H CAUSA LA

Ttulo: PRDIDA DE LA FORMACIN Y

RESORCIN SEA A TRAVS DE LA VA
TGF-1
Revista: THERANOSTICS

Factor de
8.854
impacto:

Guamn Jacqueline
Integrantes: Guerrero Bryan
Imbaquingo Madeleine
 OSTEOPOROSIS
Enfermedad sea metablica se caracteriza por reduccin de DMO Fracturas osteoporticas

Enfermedad comn que afecta hasta un 30% de mujeres y un 12% de hombres durante la vida

Trastornos genticos https://ddd.uab.cat/pub/trerecpro/2013/hdl_2072_207480/TR-HernandezdeSosa.pdf

Nuestros datos proporcionan evidencia de que la prdida parcial de la funcin ATP6V1H produce
osteoporosis / osteopenia.

Proponemos que la formacin defectuosa de osteoclastos provoca una alteracin de la formacin

sea alterando la remodelacin sea.

Investigacin gentica de osteoclastos dara a conocer que otras subunidades pueden relacionarse
con trastornos seos

En el futuro, ATP6V1H podra, por lo tanto, servir como objetivo para la terapia de la osteoporosis
 H + -ATPasa de tipo vacuolar (V-ATPasa)

ENZIMA
Necesaria para procesos intracelulares

Media la acidificacin
de orgnulos
Clasificacin Activacin
de protenas de
zimgeno
Bombea protones

acopla ATP endocitosis

Generacin de gradiente
Energa hidrlisis de protones en vesculas
sinpticas
TCIRG1 GEN MUTADO CAUSA OSTEOPOROSIS
SUBUNIDAD VOD2 SU DEFICIENCIA MEJORA LA FORMACIN SEA
 SUBUNIDADES
Subunidad C del dominio V1 regula la formacin de anillo de actina F
Subunidad V1B2 se asocia con F actina durante la polarizacin
Mutaciones en el gen ATP6V1B1 sndrome de Zimmermann-Laband y el sndrome dominante de la
sordera- onicodistrofia
 ATP6V1H
Atp6v1h knockout ratones
CRISPR / Cas9
deficiencia de ATP6V1H caus
un menor vuelco seo
La formacin sea se redujo
ms que la resorcin sea
Desequilibrio en la
homeostasis sea se produjo a
partir de interacciones
alteradas entre osteoclastos y
osteoblastos a travs de la va
TGF-1.
ESTUDIO POBLACIONAL. Se generaron 8
1.625 voluntarios chinos
ratones knockout ANIMALES
Atp6v1h utilizando el
sistema CRISPR / Cas9.
kits comerciales
TRAP (Sigma, US)
Anlisis del pH para teir
intracelular. osteoclastos
lysoSensor
DND-160 Histologa e
(Invitrogen, histomorfometra
EE.UU.)
Ensayo bioqumico y ELISA Tincin
PLINK para la prueba de asociacin y meta- inmunohistoqu
anlisis y los clculos se realizaron utilizando el Micro tomografa computarizada mica sABC
paquete de software METAL. Tincin del anillo. (Boster, Wuhan,
consola de comandos Genotyping. Medicin de la actividad de V-ATPasa. China)

ADN GENMICO: Genome-Wide Human SNP Co-cultivo de osteoblastos y osteoclastos. Ensayo in vitro de
Array 6.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.) Western blott osteoclastos.
 Estudio poblacional. Un total de 1.625
voluntarios chinos fueron reclutados de los
adultos Han del Medio Oeste chino que vivan
en las ciudades de Xi'an y Changsha.
Sujetos con enfermedades crnicas
Sujetos que toman agentes anablicos
Se generaron tres grupos basndose en la
puntuacin Z. El grupo 1 represent aquellos
con una puntuacin Z por encima de -1, el
grupo 2 entre -1 y -2 y el grupo 3 por debajo
de -2.
 Estudio poblacional. Un total de 1.625
voluntarios chinos fueron reclutados de los
adultos Han del Medio Oeste chino que vivan
en las ciudades de Xi'an y Changsha.
Sujetos con enfermedades crnicas
Sujetos que toman agentes anablicos
Se generaron tres grupos basndose en la
puntuacin Z. El grupo 1 represent aquellos
con una puntuacin Z por encima de -1, el
grupo 2 entre -1 y -2 y el grupo 3 por debajo
de -2.
Micro tomografa computarizada y anlisis.
Se exploraron los fmures y las vrtebras de los ratones 8 Ratones
Parmetros 80kV y 500A,
Tiempo de exposicin 500 ms
ngulo de exploracin 360
Micro-tomgrafo CT
La densidad sea relativa
el volumen seo (BV / TV)
la superficie sea (BS / TV)
el grosor trabecular (Tb.Th)
el nmero trabecular (Tb.N)
la separacin trabecular (Tb.Sp)
el grosor cortical
 Histologa e Histomorfometra
Ratones machos de 3 semanas (salvajes) calcena a 10 mg / kg
Ratones Atp6v1h +/- Xilenol orange a 90 mg / kg
Das 1 y 8
Cada grupo contena de 6 a 8 ratones
Etanol 70%
Fmur
4C

Tincin
inmunohistoqumica
Calcificacin
tejido
 Ensayo in vitro de osteoclastos.
La mdula sea clulas (BM) se
separaron del fmur y la tibia
6 semanas de edad
Ratones de tipo salvaje macho y
Atp6v1h +/-
Tratados glbulos rojos de
tampn de lisis
Clulas se fijaron con clulas se cultivaron en de M-CSF (50 ng / ml)
paraformaldehdo al 4%

24 horas
 SiRNA transfeccin
Sentido (5 'a 3'): AAG CAA AUG CUU CAA ATT
Antisentido (5 'a 3'): UUU GAA GCA UCU CUU GCU UTT

Sentido (5 'a 3'): UUC UUC GAA CGU GUC ACG UTT
Antisentido (5 'a 3'): ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT

Ratones se hicieron crecer a 50% a 60% de confluencia y luego

transfectadas con siRNA
 Ensayo funcional de osteoblastos.

Se cultivaron osteoblastos de calvaria (1

104 clulas / pocillo) en medio DMEM de
glucosa alta en presencia de FBS al 10%
Las placas de cultivo celular se fotografiaron
bajo un microscopio de contraste.
Tambin se recogieron los ARNm de tejidos
seos calvricos de ratones recin nacidos
de tipo salvaje y heterocigotos y se realiz la
Q-PCR.
 Anlisis del pH intracelular
Ratones de tipo salvaje y Atp6v1h +/- se trataron M-CSF Durante 7
y RANKL das
Curva de calibracin de pH al final de cada experimento
Calibrar la intensidad de fluorescencia a valores de pH
reales
Calcularon 50 clulas
Se repiti el experimento al menos tres veces.
Cebadores implicados en este estudio
ATP6V1H variants and low bone mass in a human population

Table 1
Clinical Characteristics of 1625 Han Chinese Subjects.
Group1: Spine Z score >-1; Group 2: -1, >-2; Group3: Spine Z score -2.

Sex No (%) Lumbar Spine Z-

Yr of age
Weight (kg) Height (cm) Spine BMD score
Median
Male Female Average(SD) Average(SD) Average Average
(range)
(SD) (SD)
Group 1 683 (49.4) 699 (50.6) 28 (18~82) 60.4 (10.6) 164.7 (8.1) 0.98 (0.11) 0.27 (0.82)
Group 2 108 (51.7) 101 (48.3) 34 (20~72) 58.6 (10.0) 162.2 (7.8) 0.78 (0.04) -1.36 (0.26)
Group 3 10 (30.3) 23 (69.7) 62 (25~75) 58.2 (13.9) 157.8 (8.3) 0.64 (0.07) -2.41 (0.43)

Grupos de controles de osteopenia puntuacin Z inferior a -2 se consider como un

riesgo significativo de osteoporosis
 ATP6V1H variants and low bone mass in a human population
Total Female Male
Table 2 SNP No.
Position
A1 / A2 X- X- X-
(hg18) P P P
Association of 15 Tag SNPs in ATP6V1H with Spine Z-score in 1625 Han Chinese. squared squared squared
rs37358 5479128
C/A 1.198 0.879 3.534 0.473 8.364 0.079
A1: Minor allele; A2: Major allele. A linear regression implemented in PLINK was fitted to test for association assuming an additive 33 9
inheritance model. rs16919 5479607
G/A 5.470 0.065 5.315 0.070 1.069 0.586
505 2
rs16919 5479653
G/C 7.438 0.115 7.308 0.121 2.843 0.585
507 4
rs16919 5480298
G/A 7.746 0.101 7.489 0.112 2.285 0.684
508 6
anlisis GWAS que incluy 281,533 SNPs rs47375
54
5480963
1
C/T 7.188 0.126 5.511 0.239 4.861 0.302

15 dirigidos a las regiones intrnicas del gen ATP6V1H rs47375

58
5481097
8
G/A 8.723 0.068 8.426 0.077 4.849 0.303
rs23760 5481385
T/C 10.573 0.032 7.607 0.107 7.712 0.103
11* 8
rs47388 5482070
T/C 10.830 0.029 7.176 0.127 9.199 0.056
84* 8
rs10435 5482583
C/T 10.052 0.040 4.312 0.366 10.674 0.030
587* 2
rs41321 5482625
Mltiples pruebas identificaron 4 de ellos (26,7%) que 146* 9
A/C 9.655 0.047 7.134 0.129 7.191 0.126
rs12056 5482653
tienen DMO, P <0,05 719 8
A/G 9.038 0.060 7.176 0.127 6.195 0.185
rs16919 5483494
A/G 0.351 0.839 0.178 0.915 0.173 0.917
544 4
rs15521 5483727
G/G 9.305 0.054 6.797 0.147 7.157 0.128
48 6
rs69915 5490809
G/C 1.591 0.811 1.922 0.750 5.413 0.248
13 1
rs69948 5491099
G/A 5.918 0.205 4.093 0.394 3.304 0.508
51 4
rs16919 5491424
T/C 1.714 0.788 2.116 0.714 0.649 0.958
588 4
Prdida sea y disminucin de la formacin sea en ratones Atp6v1h +/-.
tcnica CRISPR / Cas9

dise ARN gua (gRNA) para dirigir exn 2 de Atp6v1h

delecin de 5 pb (CGAGG) una sustitucin de la base (T> G).

causaron un codn de parada temprana

Todos los embriones Atp6v1h - / - homocigticos murieron

antes del da embrionario 10

Atp6v1h + / - ratones heterocigotos nacieron en la

proporcin Mendeliana esperada y exhibieron una tasa de
crecimiento normal.
Prdida sea y disminucin de la formacin sea en ratones Atp6v1h +/-.
La tincin con IHC y la tincin con fosfatasa cida resistente al La tincin de TRAP mostr un nmero y
tartrato (TRAP) tamao igual de osteoclastos en fmures
distales de los ratones Atp6v1h +/- en
ATP6V1H estaba localizado en osteoclastos. comparacin con los compaeros de camada
La tincin positiva de ATP6V1H en los osteoclastos se convirti de control
dbil en ratones heterocigotos
 Prdida sea y disminucin de la formacin sea en ratones Atp6v1h +/-.
micro-TC de alta resolucin en la calvaria los fmures y vrtebras lumbares

Table 3
Structural Parameters Measured by Microcomputed Tomography.
BS/TV
Site Mice No. BV/TV (%) Tb.N Tb.Th (m) Tb.S (m) Ct.Th (mm)
(mm2/mm3)
49.075 80.489 41.290
Femur Wild type 8 0.389 0.081 7.892 1.136 0.169 0.034
5.918 24.056 4.780
0.264 0.049 35.903 103.050 56.211 0.144
Heterozygous 8 7.311 0.937
** 3.594 ** 19.637 5.559** 0.025**
33.687 103.147 59.734
Vertebrae (L3) Wild type 8 0.249 0.033 7.379 0.752 NA
2.832 15.077 4.968
0.174 0.038 30.506 142.559 65.916
Heterozygous 7 5.934 0.817 NA
* 2.629 27.656* 5.517
Prdida sea y disminucin de la formacin sea en ratones Atp6v1h +/-.

La tincin roja de Ponceau de los tejidos microscopio electrnico de transmisin (TEM)

calcificados del hueso muestra disminucin del Atp6v1h +/- osteoclastos bordes ondulados normales
volumen seo y grosor trabecular
 Prdida sea y disminucin de la formacin sea en ratones Atp6v1h +/-.
El suero CTX-I y TRAP

Actividad de reabsorcin osteoclstica

no se alteraron en Atp6v1h + / - ratones

Las concentraciones sricas de calcio

ligeramente superiores

Niveles de fosfato srico fueron

menores en los ratones Atp6v1h +/- en
comparacin con los de tipo salvaje
Prdida sea y disminucin de la formacin sea en ratones Atp6v1h +/-.
menos formacin de cartlago y hueso

Reduccin de BFR y MAR

Prdida sea y disminucin de la formacin sea en ratones Atp6v1h +/-.
ALP tincin dbil y desigual, osteocalcina no alterado

Prdida sea y disminucin de

la formacin sea coexistieron
en ratones Atp6v1h +/-.
Un desequilibrio de las
actividades de osteoclastos y
osteoblastos.
 Alteracin de la formacin y funcin de los osteoclastos en los ratones Atp6v1h +/-

Estimulacin de clulas de mdula sea primarias (BMs) con activador del receptor del factor nuclear
kappa-B (NF- B) ligando (RANKL) y el factor estimulante de colonias de macrfagos (M-CSF ).

cultivo en una placa general de 96

pocillos

Cultivo de BMs en una microplaca de

osteoanlisis
osteoclastos menores Atp6v1h +/-, y el
rea de resorcin total, tambin se
redujo
 Alteracin de la formacin y funcin de los osteoclastos en los ratones Atp6v1h +/-

el nmero de fosas por rebanada de hueso (4 mm x 4 mm) La comparacin de la formacin de anillo de actina
disminuy, al igual que el rea de pozo promedio de Atp6v1h + / - entre el tipo salvaje y Atp6v1h + / - osteoclastos no
detect diferencias
 Alteracin de la formacin y funcin de los osteoclastos en los ratones Atp6v1h +/-

ATP6V1H en los osteoclastos de tipo

Knockdown de Atp6v1h por siRNA redujo
salvaje aument gradualmente durante los
la formacin de TRAP + osteoclastos
das 0 ~ 4
obtenidos a partir de BM estimulados con
ATP6V1H en Atp6v1h + / - osteoclastos fue
M-CSF y RANKL
menor
 Alteracin de la formacin y funcin de los osteoclastos en los ratones Atp6v1h +/-

ambiente intracelular
de Atp6v1h + / -
deficiencia Atp6v1h osteoclastos se hizo ms
alcalino en comparacin
con el tipo salvaje de
clulas

Deficiencia de Atp6v1h afecta a la formacin

de osteoclastos y la capacidad de reabsorcin
de los osteoclastos al deteriorar la actividad
de la V-ATPasa y aumentar el pH intracelular.
Disminucin de la interaccin entre osteoblastos y osteoclastos en ratones Atp6v1h +/-.

la deficiencia de Atp6v1h afect directamente a los osteoblastos?

menor expresin de Alp, Col1a1 y Bsp ARNm de Atp6v1h fue regulado en osteoblastos de cultivo
en osteoblastos inducidos por primario slo los niveles de Ocn y Opn se alteraron
osteognesis
 Disminucin de la interaccin entre osteoblastos y osteoclastos en ratones Atp6v1h +/-.

la deficiencia de Atp6v1h afect directamente a los osteoblastos?

Atp6v1h +/- osteoblastos, capacidad normal formacin

de ndulos calcificados

es poco probable un efecto autonmico de la

haploinsuficiencia de ATP6V1H sobre la funcin osteoblstica

el efecto osteoblstico es
probablemente secundario a
la formacin y funcin
reducida de los osteoclastos.
 la disminucin de TGF-1 en Atp6v1h +/-
osteoclastos
el TGF-1 sin cambios en Atp6v1h +/-
osteoblastos

ELISA revel la disminucin del TGF-1 activo en

sueros de ratones Atp6v1h +/-
Los resultados de Western blot mostraron la
disminucin de RANKL y la OPG sin cambios en
Atp6v1h +/- osteoblastos. N3. I.
Los resultados de ELISA revelaron el RANKL
(sRANKL) menos soluble en el suero y el
sobrenadante de Atp6v1h +/- osteoblastos con
induccin osteognica. N3. J.
El nivel de OPG se increment en sueros de
ratones Atp6v1h +/- y el sobrenadante de
Atp6v1h +/- osteoblastos con induccin
osteognica. N3. K.
 Varios genes influyen en la masa sea
Los defectos de ATP6V1H son asociados con la prdida de la matriz sea
en ratones y seres humanos
La disfuncin de las subunidades de V-ATPasa, codificados porTCIRG1,
ATP6V0D2, ATP6V1C1 y ATP6V1B2, se manifiestan en osteoporosis
Mecanismos:
-cambios en la acidificacin extracelular
-fusin de preosteoclastos, y el citoesqueleto F-actina conjunto de
osteoclastos
ATP6V1H fue altamente expresado en osteoclastos y el nivel de expresin
de ATP6V1H se redujo en Atp6v1h + / - osteoclastos.
El nivel reducido de ATP6V1H inhibi el nmero y el tamao de los
osteoclastos
TRAP +, alter la actividad V-ATPasa, aument el pH intracelular y
perjudic la resorcin sea osteoclstica.
 Dado que la activacin del TGF-1 es
sensible al pH y TGF-1 podra regular
las funciones de osteoclastos y
osteoblastos.
Utilizando ELISA se observ que los
Atp6v1h + / - osteoclastos cultivados en
rodajas de hueso segregaban menos
TGF-1, y que el osteoclastos inducidos
por Atp6v1h + / - osteoblastos
producido ms TGF-1
Se ha informado de que los niveles ms
bajos de TGF-1 reducen la
diferenciacin de clulas madre
mesenquimales en osteoblastos
 RANKL / OPG va tambin se
analiz para determinar si una
baja tasa de formacin de
hueso regulando la funcin
osteoclastos.
Los niveles sricos de RANKL y
OPG disminuyeron y
aumentaron respectivamente
en ratones Atp6v1h +/-
Los niveles de RANKL y OPG
procedentes de osteoblastos
primarios cultivados no se
modificaron bajo condiciones
inducidas no osteognicas.
la remodelacin sea de ratones heterocigotos se vio afectada
 ATP6V1H esta localizado en los osteoclastos su deficiencia o disfuncin produce
osteoporosis.
formacin defectuosa de osteoclastos provoca una alteracin de la formacin sea
alterando la remodelacin sea.
el papel clave de ATP6V1H es promover la formacin de osteoclastos y mantener la
acidificacin local para la resorcin sea, en lugar de afectar la estructura osteoclastos o
el movimiento
Osteoclastos y osteoblastos se regulan por medio TGF-1
La baja concentracin de TGF-1 promueve la maduracin de los osteoclastos
los niveles ms bajos de TGF-1 reducen la diferenciacin de clulas madre
mesenquimales en osteoblastos.

La deficiencia de ATP6V1H causa: prdida sea por la inhibicin de la resorcin sea y

la formacin sea a travs de la va TGF-1

ATP6V1H podra, por lo tanto, servir como objetivo para la terapia de la osteoporosis.