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CRECIMIENTO MICROBIANO

El crecimiento se define como un incremento


en el nmero de clulas
En procariotas contina hasta que se divide
en dos nuevas clulas en un proceso llamado
fisin binaria
Cada clula hija recibe un cromosoma
completo y copias suficientes de
macromolculas, monmeros e iones
inorgnicos para vivir en forma independiente
Bajo condiciones nutricionales estables la
bacteria E. coli puede completar su ciclo en 20
minutos
El tiempo es variable y depende de factores
nutricionales y genticos
CRECIMIENTO POBLACIONAL

La velocidad de crecimiento es el cambio


en el numero de clulas por unidad de
tiempo
El tiempo de generacin es el requerido
para duplicar una poblacin de clulas
Este modelo en el que el nmero se
duplica por unidad de tiempo se denomina
crecimiento exponencial
Una caracterstica es que al comienzo es
bajo y luego incrementa en una explosin del
numero de clulas
Se utiliza para ensayar el efecto positivo o
negativo de algn tratamiento sobre el cultivo
bacteriano
TIEMPO DE GENERACION
En un cultivo creciendo exponencialmente hay una relacin directa entre
el numero de clulas presentes en el momento inicial (N 0) y en un momento
determinado del crecimiento

N = N0 * 2 n

donde N= nmero final de clulas y n= nmero de generaciones

El tiempo de generacin g de la poblacin celular se calcula


como: g = t/n

donde t= horas o minutos

Los tiempos de generacin son usados para ensayar efectos positivos o


efectos negativos
CICLO PROCARIOTICO
Antiguamente se pensaba que los ciclos bacterianos carecan de eventos
calve dado que no hay mitosis y la sntesis de ADN pareca continua durante
todo el ciclo
En la actualidad se conocen fenmenos clave : fase C o de sntesis del ADN
(equivalente a la S eucaritica); replicacin del ADN; fase D que termina con
el final de la divisin celular (equivale a la M eucaritica) ; fase de intervalo
(similar a la G1 eucaritica)
Las fases C y D son relativamente constantes y cuando disminuye el tiempo
de generacin (g) lo hace a expensas de la fase G1 . En el caso de E. coli la fase
C= 40 minutos y la fase D= 20 minutos
Cuanto ms rico es un medio , el tiempo de generacin es menor y mayor es
el tamao medio de las clulas
Si se inocula una clula cultivada en un medio pobre (g=60 min, C+D= g) a
un medio ms rico (g=35 min) se observa: la primera divisin ocurre a los
60min idntico al medio anterior , pero el inicio de una nueva ronda de
replicacin ocurre antes (C+D se superponen) y se obtiene un tamao mayor
que en el medio pobre y una masa de inicio mayor
CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS
Una poblacin bacteriana presenta un patrn de crecimiento
cuando se inocula en un medio de cultivo fresco cerrado (lquido o
slido)
En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento dura slo
unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes
y/o acumulacin de desechos
En estos sistemas hay una fase de latencia (fase lag) de
retraso mientras las clulas se ajustan a las nuevas condiciones es
un perodo de ajuste metablico que depende del tamao del
inculo, bondad del inculo (estado metablico previo)
Fase exponencial o fase logartmica de crecimiento
continuo donde se da un crecimiento balanceado no restringido
durante unas pocas generaciones (menos de 10), el valor de (g)
depender de la composicin del medio, temperatura, pH,
osmolaridad
CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS
Fase estacionaria se caracteriza porque el coeficiente de crecimiento se hace
nulo pero aun existe crecimiento que se equilibra con las muertes celulares, se
agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho, incluso el pH
se hace inadecuado, aun hay reacciones metablicas pero el metabolismo es
diferente (clulas son ms chicas) al de la fase logartmica , el citoplasma se
condensa, la membrana se hace menos fluida y suele ser ms resistente a los
agentes fsicos y qumicos
Fase de muerte si la incubacin continua en la fase estacionaria, las clulas
empiezan a morir y hay incluso lisis celular , es tambin una funcin exponencial
pero ms lenta que la exponencial
CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS SLIDOS
Un medio slido es una solucin nutritiva (como el lquido), pero
incorporado a un gel, que le da consistencia.
Los tipos de gelificantes ms usados para los medios slidos: agar-agar (o
simplemente, agar) es el ms usado; gelatina (tiene el inconveniente que se
licua a temperaturas relativamente bajas)
Los medios slidos se suelen inocular mediante asa de siembra o esptula,
diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en placas de Petri .Tras la
incubacin a la temperatura y condiciones adecuadas, cada bacteria o
agrupacin bacteriana da origen, por crecimiento, a una acumulacin de clulas,
visible a simple vista, denominada colonia
La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 clulas para una
colonia de unos 5 mm). Se debe a que las bacterias no pueden dispersarse, y
durante mucho tiempo este medio slido permite un aporte continuo de
nutrientes y eliminacin continua de productos de desecho. Por lo tanto, se
parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de clulas.
Con vistas a la determinacin taxonmica, se suele tomar nota de una serie
de caractersticas de las colonias: tamao, forma general y de bordes, color,
consistencia, aspecto de la superficie y elevacin sobre el sustrato
MEDICION DEL CRECIMIENTO CAMARA DE
PETROFF HAUSSER
Se puede medir siguiendo los cambios en el nmero
de clulas o el peso de la biomasa celular
El nmero de clulas se puede medir al microscopio
y se llama recuento directo
Se puede realizar en muestras secas o lquidas para las
que se usan cmaras especiales de recuento donde el
valor de clulas es convertido a clulas por mililitro de
suspensin
Cmara de Petroff Hausser: portaobjeto especial
con graduacin en superficie y medidas concretas:
0.02 mm de profundidad
rea de 1 mm 2 dividida en un retculo de 25
cuadrados grandes
cada cuadrado grande est subdividido a su vez en
4 x 4= 16 cuadrados pequeos
la muestra se distribuye en 16 x 25= 400 celdillas
MEDICION DEL CRECIMIENTO
La muestra dispensada entre porta y cubre se deja
reposar unos minutos y se cuenta el nmero de clulas
en varias celdillas (en general 16 equivalente a un
cuadrado grande), se anota el nmero n y se establece:

n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas / ml

Limitaciones:
las clulas vivas no se distinguen de las muertas
las clulas pequeas son difciles de apreciar
se requiere habilidad para obtener precisin
se necesita contraste de fases cuando la muestra no
est teida
no es bueno para suspensiones poco densas, slo sirve
para suspensiones concentradas ( mayores a 10 x 10 6
cel./ml)
RECUENTO DE
VIABLES

El recuento en placa determina el nmero de clulas capaz de generar


colonias sobre la superficie de un medio slido
Hay dos formas, por siembra en superficie: se siembra 0.1 ml de muestra y se
extiende por la superficie con una barra de vidrio o metal
O bien, por siembra en profundidad: se siembra de 0.1 a 1.0 ml en la placa de
Petri y se agrega el medio slido fundido (40 C) y se incuba
Por este mtodo se pueden usar volmenes ms grandes
Hay que tener en cuenta que el organismo a ser contado resista temperaturas
de 40 a 45 C
El nmero de colonias que puede ser contado oscila entre 30-300 colonias
DILUCIONES

Cuando el cultivo es denso se usa


el mtodo de diluciones
Se usan diluciones seriadas en
base 10: 1.0ml de muestra en 9.0ml
de diluyente o bien, 0.5ml muestra
en 4.5ml de diluyente
El nmero de colonias depende
del inculo , medio de cultivo y las
condiciones de incubacin (medio
de cultivo, temperatura y tiempo de
incubacin)
La expresin del resultado ser
como unidades formadoras de
colonias por mililitro (ufc/ml) ya
que la ufc puede contener ms de
una clula
MASA CELULAR Y TURBIDEZ
Medida de la masa bacteriana: Mtodos directos
Se puede determinar el peso seco donde la masa seca (estufa a 105 C toda
la noche) es aproximadamente entre el 10 al 20% de la masa hmeda
Inconvenientes: mtodo tedioso que requiere tiempo y errores en pesadas ( 1
mg de peso seco equivale a una masa bacteriana de 5 x 10 9 bacterias)
o bien, el peso hmedo donde se centrifuga y se elimina el sobrenadante y
se determina el peso del sedimento
Inconvenientes: grandes errores debido al lquido intercelular retenido, tipo
y forma de las agrupaciones de la cepa, etc
Determinacin de componentes caractersticos: peptidoglicano, ARN,
ADN, protenas se usan en bacterias que forman grumos no dispersables o
crecen en filamentos en general se emplean en determinaciones en ambientes
naturales
Mtodos indirectos :
Turbidimtricos (pticos): la base comn consiste en la medicin de la
cantidad de luz dispersada o trasmitida a travs del cultivo bacteriana. La
dispersin de la luz dentro de ciertos limites es proporcional a la masa del
cultivo
MASA CELULAR Y TURBIDEZ
Escala de Mc Farland: es una
serie de patrones de turbidez
(precipitado de SO4 Ba) previamente
calibrados y se establece la
equivalencia entre la turbidez de
cada tubo y la masa o concentracin
de bacterias (clulas/ml) que genera
una turbidez similar
Un mtodo ms til es la medida
de turbidez con fotmetro o
espectrofotmetro que hacen pasar
luz a travs de las suspensin celular
y detectan la cantidad de luz no
dispersada
Los resultados se expresan en
unidades fotomtricas o
unidades de densidad ptica
proporcionales al nmero de clulas
y a la masa celular
MASA CELULAR Y TURBIDEZ
Hay que realizar una curva estndar
de calibracin que relacione medidas
directas (recuento en placa o
microscopa) con las indirectas de
turbidez
En el mtodo de turbidimetra es
necesario determinar el contenido de
ufc/ml de la muestra original (de la cual
se hicieron las diluciones para la
calibracin) con el mtodo de recuento
en placa.
Con esta informacin y las
absorbancias de las diluciones, se hace
una curva de calibracin. Teniendo esta
curva, se podr determinar las ufc/ml de
otras muestras luego de leer la
absorbancia de las mismas.
Contadores electrnicos de
partculas : se pasa una suspensin
bacteriana por un tubo capilar entre los dos
polos de una corriente elctrica
Cada vez que pasa una bacteria se
interrumpe la corriente y es recogida por un
dispositivo electrnico que detecta el
numero y tamao de las partculas que van
pasando (el tamao es funcin de la
intensidad del pulso de voltaje al paso de la
partcula)

Citometra de flujo activada por


fluorescencia (FACS): las partculas se
marcan antes con anticuerpos
monoclonales hacia alguna molcula de
superficie y se unen a un fluorocromo
(molcula que se excita al absorber la
radiacin lser y emite fluorescencia a
diferente longitud de onda)
EL QUIMIOSTATO
Es un reactor que mantiene el
crecimiento bacteriano en la fase
exponencial
Es un cultivo continuo el volumen se
mantiene constante (recambio entre
medio fresco y usado) y se alcanza un
estado de equilibrio entre el nmero de
clulas y su estado metablico
Es un cultivo balanceado mantenido por
tiempo indefinido por un sistema de flujo
que se compone: una cmara de cultivo de
volumen constante a la que llegan
nutrientes y de la que se eliminan los
productos txicos de desecho
Caractersticas: estado constante o
estable; concentracin bacteriana y
concentracin del sustrato: constante; tasa
de dilucin y rendimiento celular:
constante
Se usan dos elementos de control: la velocidad de dilucin y la
concentracin del nutriente limitante (C o N)
La velocidad de dilucin controla la velocidad de crecimiento en rangos muy
amplios y la densidad celular (clulas/ml) esta controlada por el nivel del
nutriente limitante
Los parmetros a tener en cuenta son: f (ml/h); volumen cmara de cultivo
(ml); densidad celular (x); factor de dilucin D=f/v (h -1)
Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m) se haga igual al factor de
dilucin (D), entonces dx/dt=0 y por tanto la cc de las clulas se hace constante
(x=x) y el cultivo se encuentra en estado dinmico de equilibrio

EL QUIMIOSTATO
Los MO pueden cultivarse en una amplia gama de tasas de crecimiento
exponencial y permite crecimientos balanceados y restringidos ya que el
nutriente o sustrato est presente en una concentracin baja como para limitar la
densidad de poblacin
Sin embargo, a tasas altas de dilucin la concentracin microbiana cambia
rpidamente y el cultivo puede ser lavado totalmente (dilucin crtica)
A muy bajas diluciones el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es
la fuente de energa ya que slo se usa para reacciones de mantenimiento celular y
no para crecimiento (energa de mantenimiento) como ser potencial de
membrana, trasporte activo o sntesis de protenas

EL QUIMIOSTATO
Aplicaciones:
Procesos industriales de fermentacin (produccin de bebidas alcohlicas, de
antibiticos, de aminocidos, etc)
Permite estudiar: aspectos fisiolgicos (catabolismo de sustrato limitante),
seleccin de mutantes ; estudios ecolgicos
Su aplicacin ms conocida es para la depuracin de aguas ya sea
mediante procesos aerbicos o anaerbicos . El medio de cultivo fresco es el
agua residual que entra en la planta y alimenta a los fangos activados por MO
que luego se retiran por decantacin

EL QUIMIOSTATO
FACTORES AMBIENTALES
El abanico es amplio y va desde puntos por debajo de la congelacin del agua
hasta 110 C, el rango habitual es 30 C
Se distinguen cuatro grupos:
Psicrfilos con temperaturas bajas 0-20 C,
Mesfilas con medianas 20-45 C,
Termfilas ms altas 60- 90 C
Hipertermfilas con muy altas 90-110 C
Congelacin: existe un lmite por el cual es imposible la reproduccin, hay
crioprotectores (glicerol y dimetilsulfxido) que permiten su conservacin a
temperaturas (-70 C)
Termofilia: termfilos poseen membranas ricas en cidos grasos saturados
que les dan estabilidad a altas temperaturas. Las eucariotas estn ausentes por
encima de
60 C debido a la porosidad de sus membranas
La temperatura favorece reacciones del metabolismo bacteriano:
-Acelera su capacidad de sntesis
-Velocidad de multiplicacin ms rpida
Regla de Vant Hoff: "la velocidad de las reacciones qumicas se duplica por cada
incremento de 10 C de la temperatura
FACTORES AMBIENTALES
Cloruro de
Sodio

Cloruro de sodio: el agua de mar tiene una concentracin del 3% , los


organismos que se aslan del mar tienen requerimientos especficos para el sodio
y se llaman halfilos pudiendo ser:
Moderadamente halfilo (6-15%),
Discretamente halfilo (1-6%),
Halfilos extremos (15-30%)
pH y ACTIVIDAD DEL AGUA
Acidez y alcalinidad - pH: slo unas pocas especies pueden crecer a pH
extremos, la mayora de los ambientes naturales tiene 5.9. Segn su tolerancia al
pH:
Los que crecen a pH cidos (1-5.5) son acidfilos
Los que crecen a pH bsicos (8.5-11.5) alcalfilos
Los que crecen a pH neutro (5.5-7.0) neutrfilos
La mayora de las bacterias tienen su pH ptimo (exterior) entre 5-9 y
cambian el pH de su hbitat acidificando o alcalinizando y con ello facilitan o
impiden la supervivencia de otras especies bacterianas.
Acidgenas: acidifican su entorno al liberar productos cidos
Acidricas: crecen en un medio cido y son capaces de hacerlo ms cido
Actividad el agua: la disponibilidad el agua se expresa en trminos fsicos
como actividad del agua (a w) y sus valores oscilan entre 0 y 1
Osmosis: es el proceso por el que el agua difunde desde una regin de alta cc
(baja en soluto) a una regin de baja cc (alta en soluto)
Plasmlisis: se produce cuando la clula est en ambiente con baja actividad
del agua y existe una tendencia de salida del agua intracelular
NECESIDADES DE OXIGENO
Bacterias aerbicas estrictas: utiliza concentraciones del 20% ms de
Oxgeno
Metabolismo : Alimento + O2 Material celular + CO2 + H2O
Microaerfilos: necesita concentraciones muy bajas de Oxgeno. 2-10%. Tienen
superxido dismutasa (SOD) y pueden o no tener catalasa
Bacterias anaerbicas estrictas: No tolera nada de Oxgeno. Les resulta txico
y mueren, solo crecen si hay 0.5%. No tiene ni SOD ni catalasa
El oxigeno es un txico, su metabolismo es:

Bacterias anaerbicas facultativas: utiliza oxgeno solo si lo hay. No tiene


problema para sobrevivir pero si hay oxgeno crece ms rpido, 2-8%, tienen
SOD y catalasa
Anaerobio aerotolerante: no necesita oxgeno para crecer y multiplicarse.
Tolera el oxgeno pero no lo utiliza. Tienen SOD pero no catalasa
NECESIDADES DE OXIGENO

El Oxgeno es txico para algunos porque no tienen las enzimas SOD y


catalasa, que degradan a los radicales libres del Oxgeno que son txicos. Con
estas enzimas (SOD y Catalasa), las bacterias pueden vivir con oxgeno
El consumo de oxgeno es necesario para la respiracin celular (para
obtener ATP)

Toxicidad del Oxgeno: elementos txicos:


H2O2: Perxido de Hidrgeno
O2- : radical superxido
OH- : radical hidroxilo

Enzimas que intervienen:


Superxido dismutasa: 2 O2 + 2 H+------H2O +O2

Catalasa o peroxidasa: H2O2--------------H2O + O2