Clonacin de genes en

animales.
Mara Paula Canchila V
Ingeniera Gentica
Biologa
Universidad de Sucre
 Contenido.
Introduccin.
Definicin.
Transferencia de ADN a clulas animales.
Vectores de transferencia gnica.
Caractersticas del vector.
Transfeccin de clulas somticas animales.
Transgnesis.
Transgnesis por microinyeccin de zigotos.
Transgnesis por manipulacin de clulas embrionarias.
Transferencia gnica por microinyeccin.
Transferencia gnica con transposones.
Transferencia gnica mediada por semen.
Articulo
Problemas
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusin.
 Introduccin.
La clonacin es un proceso normal en la naturaleza de
organismos unicelulares, plantas, insectos e incluso seres
humanos.

Clonacin artificial a permitido un desarrollo alto

Bondades potenciales:
Clonar tejidos y
rganos.
 Introduccin.
Expresin gnica en tiempo y espacio

Dependen

Diferenciacin celular y Clulas totipotentes

desarrollo embrionario. del blastocisto y
organismos adultos.

El descubrimiento de la estructura qumica de la doble hlice

Avance a la revolucin
Biotecnolgica y logros
en la clonacin.
 Definicin.
La palabra clon proviene del griego klon y significa: brote,
vstago o retoo.

Conjunto de clulas o poblacin de individuos originados de una

sola clula o individuo al que son genticamente idnticos.
Fin ultimo

Obtener una poblacin de varios individuos genticamente

homogneos o caractersticas seleccionadas.
 Transferencia de ADN a clulas
animales.
Las clulas animales pueden incorporar ADN por distintos
mtodos:

Microinyeccin directa.
Electroporacin.
Liposomas.
Vectores basados en virus.
Mediada por clulas germinales.

La transferencia de genes depende:

Introduccin de secuencias integracin del ADN

de ADN en ncleo de clula en un sitio del
somtica cromosoma
 Vectores de transferencia gnica.
Vehculo empleado para introducir ADN en una clula u
organismo.

Virales: Obtenido de un virus eliminar caractersticas

patolgicas (transportador de MG heterlogo)
Procesos de evolucin BACTERIAS
complejos.

No virales: Sntesis en lugar de modificacin.

Transporte
Estructuras Reconstruir de genes en
sencillas un sistema el interior de
conocidas artificial la clula.

Inyectores sin aguja y electroporacin

www2.uned.es
 Vectores de transferencia gnica.
El vector es una parte importante en el sistema de
transferencia gnica, el sistema consta de dos
componentes:

Vector vehculo de transporte.

Plasmdico (ADN
bicatenario y
Cargo material a ser transportado. circular)
oligonucletido o
cromosoma
artificial
 Caractersticas del vector.
Reproducible.
Estable.
Permita la insercin de material gentico sin restriccin de tamao.
Alcance concentraciones elevadas (> 108 partculas/ml).
Permita la transduccin tanto de clulas en divisin como
quiescentes.
Posibilite la integracin especfica de gen.
Reconozca y acte sobre clulas especficas.
Expresin del gen regulada.
Carecer de elementos que induzcan una respuesta inmune.
Caracterizado completamente.
Inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios.
Fcil de producir y almacenar a coste razonable.
 Transfeccin de clulas somticas
animales.
til para el cuidado medico y veterinario de enfermedades
genticas, y otros propsitos teraputicos o de
mejoramiento de animales.

Muchos
Mas eficiente individuos.
Propagacin Menor costo.
masiva celular. Mas complejo.
 Transgnesis.
Introduccin de ADN extrao en un genoma
Estable.
Hereditaria.
Afecte a todas las clulas. Cigoto + transgen

Siguientes
O transgnico. generaciones,
lnea germinal

Estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulacin.

Manipular de forma especfica la expresin gnica in vivo.
Estudiar la funcin de genes especficos.
Utilizar a mamferos como biorreactores para la produccin de
protenas humanas.
La correccin de errores innatos de metabolismo mediante terapia
gnica.
 Transgnesis por microinyeccin
de cigotos.
Primera fase: se aslan un # grande de vulos
fertilizados. Tratamiento hormonal en Hembras.
Superovulacin.

Segunda fase: zigotos obtenidos se manipulan con una

micropipeta a modo de aguja introduccin de ADN.

Tercera fase: vulos son reimplantados en hembras

nodrizas permitiendo la gestacin hasta trmino.
 Transgnesis por manipulacin de
clulas embrionarias.
Introduccin de ADN extrao en clulas embrionarias
totipotentes (clulas ES) o clulas embrionarias madres (clulas
EM).
Reintroduccin en
ADN extrao
Interior de la blstula e implantacin
en Clulas SE
blstula en hembra.

Cerda Genie fabrica en su leche la protena C humana que

controla la coagulacin sangunea y es necesaria para los
hemoflicos.
 Transferencia gnica por
microinyeccin.
Microinyeccin pronuclear: Pequeas cantidades del ADN
(transgen) se inyectan en el proncleo de un embrin al
estado de dos clulas.
 Transferencia gnica por
microinyeccin.
Microinyeccin de ADN en clulas embrionarias:
Transformacin gentica mediante recombinacin homloga
en clulas madre embrionarias (ES cells).
Macizo celular interno
de blastocistos
 Transferencia gnica con
transposones.
Elementos transponibles que contienen genes adicionales a
parte de los necesarios para la transposicin y estn dentro de
secuencias repetidas.
Capacidad del saltar fuera y
dentro del genoma.

Autorreplicarse e integrarse
aleatoriamente en nuevos
sitios dentro del genoma
 Transferencia gnica mediada por
semen.
Introduccin de ADN forneo en gametos masculinos antes
del proceso de fertilizacin.

No cuentan con la misma de la maquinaria molecular y

bioqumica de clulas somticas.
Replicacin de ADN ADN compactado a
Transcripcin de genas modo de cromatina
Sntesis de protenas. condensada

Actan de vectores de
su propio genoma
durante la fertilizacin.

Pueden transformar genticamente un alto nmero de

embriones en un solo paso.
CLULAS MADRE ESPERMATOGONIALES (SSC)
 Problema.
Mutacin de Fah en hepatocitos de un modelo de ratn
Fenotipo de perdida
de peso corporal

Mutaciones en el gen Crygc o el gen de la distrofina (Dmd)

Coinjeccin de
Cataratas o
ARNm de Cas9
distrofia muscular
ARNs a alelos
de Duchenne
(Crygc) mutantes

Seleccin de
colonias SSC o CRISPR -Cas9 para
SSC individuales terapia gnica.
 Metodologa.
Construccin del sistema CRISPR/cas9

Tijeras moleculares. Insercin

Edicin del de
genoma Secuencia de ADN. cambios.

Puntos Proteina cas9:

concretos del Actividad nucleasa.
genoma.

ARNg: Dirige
Cas9 a secuencia
a editar.
Emmanuelle Charpentier y Jennifer A. Doudna. Nature 2013.
 Metodologa.
Derivacin de SSC EGFP-SSC y Crygc -/- SSC lneas.

C kit - y CD9 + Testculos de 6,5 das de edad

Diferenciar las
espermatogonias Clulas
madres
germinales.

Se sembraron clulas CD9 + en las clulas alimentadoras de

fibroblastos embrionarios de ratn (MEF)

T: 37 C
Atmsfera de CO2 al 5% en
aire
 Metodologa.
Electroporacin de SSC

Para mutacin de mltiples genes endgenos, los plsmidos

pX330-mcherry que albergan sgRNAs se transfectaron
simultneamente en SSC.

24 h despus de la transfeccin, los SSC que expresan mCherry

se separaron con citometra de flujo y se plaquearon en
alimentadores MEF.

Colonias individuales se recogieron y se expandieron para

genotipado o trasplante.
 Metodologa.
Electroporacin de SSC
Despus de clasificar SSC que tenan protena fluorescente
con citometra de flujo durante 2 rondas.

Establecimiento de lnea SSC que expresaba EGFP y

mRFP. Para derivar lneas SSC de SSC individuales, se
adopt FACS usando un clasificador de clulas BD
FACSAriaII para depositar una clula mCherry-positiva en
cada pocillo de las placas de 96 pocillos.
 Metodologa.
Derivacin de SSC

Trasplante de SSC ratones machos F1 o EGFP

tratados con busulfn (40 mg / kg)
Protena producida
por Aequorea
victoria

105 clulas se inyectaron con una micropipeta (puntas de 60 m

de dimetro) en los tbulos seminferos de los testculos de los
ratones receptores a travs del conducto eferente.
 Metodologa.
ROSI ovocitos detenidos en la metafase II de hembras
superovuladas
Suspensiones de clulas testiculares se
filtraron a travs de un filtro de 40 m (Millipore).

PBS 8%
de FBS
Clulas haploides se
clasificaron con citometra de
flujo.
Espermtidas redondas se
inyectaron en los oocitos en Embriones de 2 clulas se
medio HEPESCZB (5 g / ml de transfirieron a los oviductos
citocalasina B). de las hembras.
Los fetos vivos nacieron el
Pipeta rompedora de da 19.5 de la gestacin.
Piezo.
 Metodologa.
Secuenciacin de bisulfito
Observar
Mapeo de
metilaciones
metilaciones alelo-
adems de la
especficas en las
secuencia
islas CpG.
nucleotdica.

Regiones promotoras
de genes
Observacin del fenotipo de la catarata

Las pupilas del ratn se dilataron durante 5-10 minutos con

gotas de ojo tropicamida compuesto antes de fotografiar.
 Metodologa.
Secuenciacin de ADN de locus especifico.

Secuencias de ADN genmico alrededor de los sitios de

mutacin EGFP o Crygc se amplificaron mediante PCR
con cebadores especficos.

Los productos de PCR de cada lnea de SSC se clonaron

en el vector de clonacin TA de pMD18T (Takara) para la
transformacin. Despus de un cultivo durante la noche a
37 C, se seleccionaron 8-16 colonias al azar y se
secuenciaron.
 Metodologa.
Secuenciacin genmica aleatoria (WGS)
Fragmentacin de 1 g de gDNA a
aproximadamente 300 pb por
ultrasonicacin por sistema Covaris
S2.

Las lecturas que

Las bibliotecas de calidad garantizada se pasaron el control
secuenciaron en Illumina Hiseq 2000 para de calidad se
lectura de pares de 100 pb. Las lecturas de convirtieron en
secuenciacin en bruto se filtraron por archivos rpidos.
primera vez para eliminar lecturas
emparejadas de baja calidad.
 Metodologa.
Secuenciacin de bisulfito de todo el genoma (WGBS)

Detectar el estado de metilacin del ADN de las regiones

germinales de impresin en ambas mutantes Crygc y
CRISPR reparado muestras.

Slo se analizaron sitios CpG con cobertura de lectura 3.

Para comprobar la consistencia de la metilacin del ADN
entre las dos muestras, slo se centr en los sitios CpG
cubiertos en ambas muestras.
 Resultados.
Viabilidad de la edicin de genes mediada por CRISPR-
Cas9 en SSC.

La factibilidad de usar el sistema CRISPR-

Cas9 para la edicin de genes en SSC (Fig 1A)

Clasificacin celular activada por fluorescencia (FACS).

sgRNA al transgn EGFP

(EGFP-sgRNA) y plsmidos
pX330-mCherry transfectados
que expresaban Cas9 y EGFP-
sgRNA
 Resultados.
Mutacin eficiente de genes endgenos en SSCs por
CRISPR-Cas9.
El sistema CRISRP-Cas9 tambin podra ser
aplicado para estudiar la funcin del gen por
la mutacin de un gen endgeno en SSC

Crygc del de 1 pb en exn 3 conduce a un codn de parada

en el aminocido 76 y produccin de cristalina C truncada,
dando lugar a cataratas nucleares tanto en ratones homocigotos
y heterocigotos para la mutacin.

25 colonias de SSC. La secuenciacin de ADN de productos de PCR

obtenidos del sitio diana amplificado mostr que 21 colonias
llevaban genes Crygc mutantes en uno o dos alelos.
 Resultados.
La reparacin gentica en SSC mediada por CRISPR-
Cas9.

La implementacin exitosa de este sistema permitira

as la generacin de individuos modificados con
genes deseados con una eficiencia del 100%

Delecin de 1pb en
ambos alelos del
Crygc gen (Crygc -
Los datos de secuenciacin de alto rendimiento 4W-SSCs y Crygc -
/ - 8W-SSC)
revelaron un cariotipo normal de los SSC y un
marco de lectura abierto bien rescatado del gen
Crygc mediada no introduce variaciones
significativas en el nmero de copias.
 Discusin.
Estudios muestran un gran potencial en el sistema
CRISPR-Cas9 a la terapia gnica.

Aunque la inyeccin directa del sistema CRISPR-Cas9 en

cigotos no pudo producir progenie sana con una eficiencia
del 100% y podra generar potencialmente modificaciones
fuera del objetivo. Para evitar estos problemas, la
estrategia posible es corregir los defectos genticos en las
clulas germinales, como SSC.
 Discusin.

Adems del uso potencial en casos en los que el padre

tiene un defecto gentico homocigtico, tambin podra
aplicarse para tratar otras condiciones genticas:
infertilidad masculina inducida por defectos genticos,
alelos de enfermedad dominante portadora del padre, y
enfermedades genticas dominantes relacionadas con el
cromosoma sexual.
 Conclusin.

El sistema CRISPR-Cas9 es un sistema que puede ser la

clave par el avance de la terapia gnica, por inducir y
corregir anomalas con fines curativos y cientficos.
 Muchas
Gracias!!!