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AO DE LA CONSOLIDACION DEL MAR DE GRAU

CITOGENTICA

UNIVERSIDAD PERUANA LOS ANDES


FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MEDICA
ESPECIALIDAD DE LABORATORIO CLINICO Y ANAT. PATOLOGICA

LIC. TRIGOSO AVALOS WILSON E.


CTMP 6226
CITOGENTICA
MOLECULAR
CITOGENTICA MOLECULAR
Desarrollo de las tcnicas de Citogentica Molecular que utiliza
las ventajas de la Citogentica clsica y de la Gentica
Molecular.
HIBRIDACION IN SITU POR FLUORESCENCIA
(FISH)
La tcnica del FISH es un procedimiento de citogentica
molecular que se fundamenta en el uso de sondas ADN
dirigidas especficamente para reconocer secuencias conocidas
del ADN cromosmico (Hibridacin) y su posterior
visualizacin mediante la fluorescencia, puesto que las sondas
estn marcados con fluorocromos.
La hibridacin in situ es una tcnica de gran sensibilidad que
permite detectar y localizar secuencias especficas de cidos
nucleicos en cromosomas, clulas y tejidos preservados
morfolgicamente.
CITOGENTICA MOLECULAR: FISH
La tcnica utiliza fragmentos de ADN ARN marcados
(sondas), que hibridan especficamente con sus secuencias
complementarias de ADN presentes en cromosomas,
clulas interfsicas y mitocondrias ARN citoplsmico,
formando hbridos estables que luego pueden ser
detectados.
La tcnica de hibridacin in situ fue desarrollada en 1969
por Gall y John en dos grupos de trabajo independientes.
Cuando se describi por primera vez, la nica posibilidad
de marcaje para las sondas era la radioactividad, y la
autorradiografa la forma de deteccin.
Po otro lado, no estaban desarrolladas tcnicas de clonaje
de cidos nucleicos y las nicas sondas disponibles eran
secuencias aisladas por tcnicas bioqumicas.
Citogentica Molecular: FISH
La posibilidad de clonar cidos nucleicos y la mejora de las
tcnicas de marcaje han permitido que la hibridacin in situ, se
utilice rutinariamente en hospitales para diagnstico y
seguimiento de muchas enfermedades.

En estos ltimos aos el marcaje de las sondas ADN con


fluorcromos han permitido desarrollar la metodologa del
FISH la que se basa principalmente en la hibridacin in situ,
mediante este mtodo es posible la deteccin y localizacin de
secuencias especficas de cidos nucleicos en estructuras
biolgicas morfolgicamente conservadas.

Este mtodo emplea la capacidad que tiene la Sonda ADN de


encontrar en algn lugar del genoma, una secuencia de ADN
complementario y de unirse hibridizar especficamente con
ella.
Citogentica Molecular: FISH

La Sonda para que cumpla su funcin debe ser de simple


hebra y de una secuencia u origen conocido.
Si la sonda y el ADN problema hibridizan la seal fluorescente
podr ser observada mediante el microscopio de fluorescencia
y as poder confirmar la presencia del segmento cromosmico
en estudio.
Para poder poner de manifiesto la hibridacin se utiliza un
sistema de deteccin muy especial y sensitivo basado en el uso
de Sondas Biotiniladas, no radioctivas. Las sondas para FISH
disponibles en el mercado pueden ser marcadas con:
1. BIOTINA, la cual se une a la Avidina que previamente ha
sido unida al Isotiocianato de fluorescena (FITC)
2. DIGOXIGENINA, que podr ser detectada con
Fluorescena o Rodamina unida a la Antidigoxigenina.
Citogentica Molecular: FISH
La visualizacin de la seal emitida por estos fluorcromos es
facilitada por la tincin de los ncleos en interfase y metafases
con un medio de montaje que contiene tincin de contraste. Se
utilizan como contraste el Ioduro de Propidium cuando se
emplea la Fluorescena y el 4,6-diamino-2fenil-indol (DAPI) para
la Rodamina.
La especificidad y utilidad del FISH va ha depender del
problema a resolver y de la sonda elegida. En general existen 3
tipos de sondas:

1. Sondas de Secuencias Repetidas o Sondas Alfa Satlites:


Que identifican secuencias generalmente pericentromricas,
muy repetidas, de cada cromosoma, producen seales que se
detectan fcilmente y pueden usarse en metafase e interfase.
Se utilizan generalmente para detectar ANEUPLOIDAS.
Citogenetica Molecular: FISH

2. Sondas de Cromosomas Completos o Sondas Paiting


Son un conjunto de sondas que hibridan especficamente a lo
largo de todo el cromosoma. Solo se utilizan en clulas en
metafases y permiten la identificacin del par cromosmico que
deseemos.
Son de gran utilidad para:
- Identificar segmentos cromosmicos de origen desconocido
-Identificar el origen de cromosomas que participan en un
rearreglo complejo.
- Identificacin de cromosomas marcadores, imposibles de
determinar por la citogentica clsica.
Citogentica Molecular : FISH
3. Sondas de ADN de secuencias nicas:
Son sondas mucho ms especficas que reconocen un locus
determinado y pueden reconocer un gen, incluso una parte de
l (desde 1000 pb hasta 300,000 pb).
Se utilizan en la deteccin de MICRODELECIONES que no
pueden detectarse por citogentica clsica y que son
responsables de diferentes sndromes.
Tambin son de gran utilidad en el diagnstico, pronstico y
seguimiento de enfermos de cncer que presentan clulas con
microdeleciones, translocaciones que involucran regiones
crticas amplificaciones gnicas.
Hasta ahora podan hacerse estudios utilizando varias sondas
diferentes simultneamente, con la nica limitacin de que los
fluorcromos disponibles pudieran ser detectados como colores
distintos por el ojo humano, a travs de un microscopio.
Citogentica Molecular:FISH

En la actualidad ya se han puesto a punto la tecnologa


necesaria para el anlisis automtico de imgenes, que
permite la utilizacin simultnea de multitud de sondas
marcadas con mezclas de fluorcromos (FISH Multicolor)
que son percibidas como colores diferentes por el analizador,
aunque son distinguibles por el ojo humano.
Esta tecnologa permite hibridar todos los cromosomas
simultneamente, obtenindose un cariotipo de 24 colores, o
incluso obtener un patrn de colores asignando diferentes
combinaciones de fluorcromos a sondas de regiones
cromosmicas diferentes.
En conclusin podemos decir que el FISH es una tcnica de
gran sensibilidad y especificidad, que mejora la capacidad de
la citogentica clsica en la deteccin de alteraciones.
FISH de nucleos interfsicos con una sonda centromrica para el
cromosoma 21 se muestran tres seales
FISH de una microdelecin en uno de los cromosomas 15 (flecha) , de
un nio con Sindrome de Prader-Willi
Pintado de cromosomas para mostrar una sutil translocacin entre los
cromosomas 10 (azul) y 18 (rojo)
FISH mostrando una falla en la sonda especfica del locus WT1 (rojo)
en el cromosoma 11 defectuoso de un paciente con sindrome WAGR.
La sonda verde actua como marcador centromrico cromosoma 11
FISH mostrando una falla en la sonda especfica del locus PAX6
(rojo) para hibridar en el cromosoma 11 de un nio con Sindrome de
WAGR. La sonda verde actua como marcador centromrico del
cromosoma 11
FISH mostrando una delecin del cromosoma 4p (rojo) en un nio
con Sndrome de Wolf-Hirschhorn. La sonda amarilla acta como
marcador centromrico del cromosoma 4
Pintado de cromosomas 5 se observa una insercin de un pequeo
fragmento del cromosoma 13 (indica la flecha)
Pintado del cromosoma 13 en donde se observa material del
cromosoma 13 insertado en el cromosoma 5 (flecha)
Pintado de cromosomas mostrando dos cromosomas 17 normales y un
pequeo cromosoma en anillo.
FISH mostrando Hibridacin del cromosoma Y (amarillo) con el
brazo corto del cromosoma X en un varn 46XX
FISH MULTICOLOR
Citogentica Molecular
Hibridacin Genmica Comparativa (CGH)
La CGH es una tcnica de citogentica molecular que permite
determinar amplificaciones y deleciones de material gentico.
Su aplicacin se ha centrado bsicamente en los estudios
tumorales.
En los ltimos aos, la investigacin gentica del cncer a
travs de la citogentica clsica ha encontrado limitaciones,
porque en muchos casos el cultivo celular de los tumores no es
todo lo bueno que se deseara, ya que no es fcil obtener
metafases analizables, adems en cada tumor pueden existir
diferentes clones, haciendo del estudio citogentico una ardua
y difcil tarea e imposibilitando muchas veces el diagnstico.
La necesidad de encontrar una tcnica que permitiera el
estudio de cualquier tipo de tumor, evitando el cultivo celular
y con ello los problemas que ste conlleva, impulso el
desarrollo de la CGH.
Citogentica Molecular: CGH
La CGH es especialmente usado para revelar regiones
importantes en la iniciacin y progresin tumoral como:
- La amplificacin o ganancia de ADN
- Deleciones perdida del ADN
- Origen de cromosomas marcadores supernumerarios
El procedimiento del CGH bsicamente consiste en partir de un
ADN tumoral marcado con un fluorcromo de un color
determinado (verde), que se compara con un ADN normal
(control) marcado con otro fluorcromo de distinto color (rojo).
Ambos ADN (uno rojo y otro verde) compiten en la hibridacin
sobre metafases previamente obtenidas a partir de un cultivo de
sangre perifrica de un individuo normal.
Luego mediante el uso de un microscopio de fluorescencia que
tiene unido un equipo automatizado (ordenador y cmara), se
pueden determinar las ganancias y prdidas del material
gentico del tumor.
CGH mostrando areas de amplificacin gnica y reduccin (delecin)
en tumores
Citogentica Molecular:CGH
Deteccin de Sondas con Marcacion Indirecta
Kit de deteccin Reactivo de Deteccin Contraste
Digoxigenina-FITC Anti-digoxigenina marcada 0.3 ug/ml de
con fluorescena Ioduro Propidium
DigoxigeninaRoda Antidigoxigenina marcada 0.1 ug/ml DAPI
mina con Rodamina
Biotina-FITC Avidina marcada con 0.3 ug/ml IP
fluorescena
Biotina-Rojo Texas Avidina marcada con Rojo 0.1 ug/ml DAPI
Texas
Deteccin doble Mezcla de reactivos 0.1 ug/ml DAPI
simultanea
Citogentica Molecular
Citogenetica convencional Fish (Interfase)
Requiere clulas en divisin . No requiere clulas en divisin
Anlisis global de todos los cromo- . Permite anlizar gran nmero
somas de clulas.
Admite el anlisis de pocas clulas . Anlisis rpido y sencillo.
(15-100) . Permite conocer el tipo de clula
La interpretacin precisa de mucha analizada y la frecuencia real
experiencia. de clulas con la alteracin
. Bajo costo econmico cromosmica frente a la pobla-
. No permite establecer a que clula cin celular total .
pertenece el cariotipo analizado. . Anlisis puntual de la alteracin que
detecta la sonda.
. Elevado costo econmico (a ms son-
das empleadas, mayor costo).
. La deteccin de prdidas cromos-
micas es conflictiva ya que siempre
se observan clulas sin seal de hi-
bridacin (falsas monosomias)
. Deteccin de falsas seales de hibri-
dacin (background).
Citogenetica Molecular
Comparacin entre citogenetica y las tcnicas de biologa
molecular
Citogentica FISH Southern PCR
Material de clulas en cultivo No requiere No requiere No requiere
estudio cultivo cel. cultivo cel. cultivo cel.

Cantidad de 2x106 clulas 1000 clulas 2x106 clulas 1 clula


material

Sensibilidad 5-10% depende de N 1-10% 1 sobre 105


clulas analizar clulas

Tamao de las 1000 pb 100-400 pb 500 pb 1 pb


alteraciones

Tiempo de 5-7 das 2 a 3 das 4 das 1 da


realizacin

Costo Bajo elevado elevado elevado

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