PATOLOGIA CLINICA

Integrantes:
Magda Garzn
Vernica Obando
Edwin Tapia
Bladimir Pantoja
Fernando Portillo
Julio Rubio

Profesor: Carlos Alberto Chvez

Universidad de Nario
SERODIAGNSTICO
Tcnica de laboratorio que permite mediante
la formacin de reacciones inmunolgicas
provocadas en el suero sanguneo (pruebas
serolgicas) determinar la aparicin de
anticuerpos, frente al agente infectante.

http://serologiade.blogspot.com.co /
SEROLOGA
Es un examen de sangre que se utiliza para
detectar la presencia de anticuerpos contra
un microorganismo. En los anlisis
serolgicos se buscan anticuerpos especficos
producidos porel sistema.

http://www.suizavet.com/toma-de-muestras.php
 Las respuestas inmunitarias contra la mayora
de los antigenos inducen la produccin
especifica de anticuerpos y linfocitos T
efectores.
Este reconocimiento entre el antigeno
anticuerpo o linfocito sienta las bases del
diagnostico inmunolgico.
SEROLOGIA
La medicin de las interacciones Antigeno-
Anticuerpo con fines diagnsticos.
Se realizan en 2 vas:
Utilizacin de anticuerpos especficos
para detectar el antigeno.(diagnostico
directo)
Utilizacin de antigenos especficos para
detectar anticuerpos. (diagnostico
indirecto)
 La reaccin entre el Ag y el Ac es de
naturaleza fsica y qumica.
La fuerzas que los mantienen unidos, son de
tipo no covalente, como la atraccin
electrosttica, los puentes de hidrgeno y las
fuerzas de Van der Waals.
CARACTERSTICAS
AFINIDAD DEL ANTICUERPO

Es la fuerza de
unin entre el Ac con
su Ag
Determina la
atraccin entre ellos.
Esa fuerza es la
suma de las fuerzas
de los enlaces que
intervienen en la
unin.
AVIDEZ DEL ANTICUERPO

Es una medida de la fuerza de

unin y estabilidad del complejo:
Ag multivalente Ac multivalente.
Ac multivalentes: Tienen ms
de un punto de unin para
Antgenos.
Ag multivalentes: Tienen varios
determinantes antignicos (ms
de un punto de unin para los Ac).
La fuerza de unin es mayor
que la suma de las afinidades de
cada uno de los puntos de unin
ESPECIFICIDAD DEL
ANTICUERPO
Si un anticuerpo reacciona solo con un Ag:
Es muy especfico.
Si un Ac reacciona con varios Ag: Tiene
una especificidad baja. Se habla de
REACTIVIDAD CRUZADA.
Esto ocurre porque varios antgenos tienen
uno o ms determinantes antignicos iguales
o similares, capaces por tanto de unirse al
mismo Ac.
TOMA DE MUESTRA
Muestra: suero.
Se debe obtener en forma asptica.
No usar anticoagulante.
Dejar coagular la sangre en forma inclinada.
No refrigerar hasta que el coagulo se haya
retrado.
Transportar en refrigeracin.
Almacenar el suero en congelacin.
VOLUMEN RECOMENDADO
La cantidad de sangre que se obtendr
depende de la especie animal:
Bovinos 10 ml.
Equinos 10 ml.
Cerdos 5 ml.
Ovinos y caprinos 5 ml.
Pollos 1 ml.
Gallinas 2 ml.
Perros y gatos 2 3 ml.
REACTIVOS
ANTIGENOS.
Constituidos por el microorganismo o parsito.
1. Antigenos crudos: presentan el inconveniente
de dar reacciones heteroespecificas.
2. Antigenos puros.
3. Antigenos altamente purificados:
Anticuerpos monoclonales.
Grmenes recombinantes.
BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO
Los sueros deben estar en buenas condiciones no
hemolisados.
El suero debe agitarse suavemente, pues los
anticuerpos sedimentan.
Los antigenos debern conservarse en
refrigeracin.
Realizar controles de calidad a los antigenos,
peridicamente.
Monitorear la temperatura del laboratorio (18 26
grados centigrados)
BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO
El tiempo de incubacin debe controlarse
con precisin.
No se debe mantener los reactivos a
temperatura ambiente mas de lo necesario.
Manejar los materiales que se usaron como
si fueran infecciosos.
Utilizar controles positivos y negativos.
No se debe hacer modificaciones al
protocolo de la prueba recomendado.
CARACTERISTICAS DESEABLES EN LAS PRUEBAS DE
INMUNODIAGNOSTICO

Utilizar pequeas cantidades de reactivos.

Sensibles y especificas.
Reproducible.(nter laboratorios)
Antigenos inactivados.
Sencilla.
Equipo y reactivos accesibles, econmicos.
CATEGORIAS DE LAS PRUEBAS
INMUNODIAGNOSTICAS
1. Pruebas de unin primaria.
Miden la cantidad de inmunocomplejos
(unin antigeno-anticuerpo), utilizando
radioistopos, colorantes fluorescentes o
enzimas.
ELISA
Inmunofluorescencia.
PRUEBAS DE UNION
SECUNDARIA
Los complejos se agregan y originan
fenmenos perceptibles visualmente. Son
reacciones no reversibles.
Dependen en gran medida del estado fsico
del antigeno, de la temperatura, de los
electrolitos presentes en la reaccin, de la
afinidad y avidez en la interaccin
antigeno-anticuerpo, proporcin entre
ambos, tipo de inmunoglobulina presente.
CATEGORIAS DE PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS
2. Pruebas de unin secundaria:
La reaccin antigeno anticuerpo va
seguida de una segunda reaccion.
Si el antigeno es soluble la reaccin que se
da es de precipitacin.
Si el antigeno es particulado (suspensin) la
reaccin es de aglutinacin.
 Son de menor sensibilidad que las primarias,
pero mas clsicas.
PRUEBAS DE UNION SECUNDARIA
Aglutinacin: en placa, en tubo.
Precipitacin: Inmunodifusion en agar,
inmunoelectroforesis
Hemoaglutinacin.
Inhibicin de la hemoaglutinacin.
Fijacin de complemento.
Neutralizacin y Seroneutralizacion
realizadas in vitro.
CATEGORIAS DE PRUEBAS
INMUNODIAGNOSTICAS
Pruebas de unin terciaria.
Evalan la capacidad de los anticuerpos de
neutralizar la capacidad biolgica de un
antigeno ( virus, toxinas).
Identificacin de toxinas.
Identificacin de virus
Medir la actividad de un anticuerpo para
neutralizar a un microorganismo.
Pruebas de proteccin (anticuerpos)
 Se basan en la medicin de las
manifestaciones biolgicas que el sistema
inmune desarrolla frente a un antgeno en el
animal, incluyendo la evaluacin del efecto
protector real de los anticuerpos o su
capacidad de neutralizar la accin biolgica
del antgeno.
OBJETIVOS DE LA SEROLOGIA

Identificacin de problemas de salud.

Determinacin de la distribucin de una
enfermedad.
Determinacin de la incidencia y prevalencia de
una enfermedad.
Evaluacin del sistema inmune del individuo o de
una poblacin.
Medicin de la inmunidad materna.
Programacin de calendarios de vacunacin.
Evaluacin de programas o campaas de
vacunacin.
 patologa clnica
serologa

HEMOAGLUTINACION
CONCEPTOS Rta inmune

Inmunidad hemaglutinacin serologia

diagnostico
ANTICUERPOS Y HEMAGLUTINACIN

La aglutinacin es un agregado de clulas o partculas debido a una

formacin entrelazadas, En las reacciones de aglutinacin, un
anticuerpo puede unirse a la vez a dos antgenos, as mismo cada
antgeno puede unirse a varios anticuerpos y formar un entramado
de complejos antgeno-anticuerpo.
ANTGENOS
RX AG----AC
Anticuerpos policlonales y monoclonales
HEMAGLUTINACIN

Dos fases bsicas:

1.- Rx Ag---Ac
2.- partculas agregadas
HEMAGLUTINACIN
En estas tcnicas se hacen
visibles los complejos Ag-Ac
por la aglutinacin que
producen los anticuerpos
cuando el Ag forma parte o se
ha unido artificialmente a la
superficie de glbulos rojos,
plaquetas, leucocitos etc.
Hemoaglutinacin directa

La presencia de antgenos en la superficie

de los glbulos rojos se puede detectar
por la hemoaglutinacin producida cuando
se aade un antisuero con anticuerpos
frente a dichos antgenos.

identificacin de los grupos sanguneos y Rh, para lo cual a la sangre

heparinizada se le aaden los antisueros correspondientes: anti-A,
anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habr aglutinacin
cuando los glbulos rojos posean la especificidad del antisuero
aadido. De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la
determinacin de los distintos grupos Rh.
Hemoaglutinacin indirecta

Se basa en el principio de la inhibicin de la hemoaglutinacin.

Para su realizacin se precisan glbulos rojos a los cuales se les
ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar.
 Incompatibilidad en las
transfusiones de sangre

aglutinacin

Grupo A: Tiene protena A en la

superficie del glbulo rojo.

Grupo B: Tiene protena B en la

superficie del glbulo rojo.

Grupo AB: Tiene ambas

protenas A y B.

Grupo O: No tiene ninguna (A o

B) en la superficie del glbulo
rojo
 E.L.I.S.A
Enzyme
Linked
Inmuno
Sorbent
Assay

https://www.pig333.com/3tres3_common/art/pig333/4500/company_news_4500_E
LISAjpg
 Las aplicaciones mas interesantes se
iniciaron en el campo de la microbiologa y
parasitologa, por los grupos de Alister Voller
y Dennis Ruiteberg en el Institutr of Public
Health del estado de Dutch.
Voller y Bidwell introdujeron el uso de placas
de 96 pocillos.
 IMPORTANCIA
Son Utilizados en el Dx Medico, la industria de
alimentosy el estudio y control del medio
ambiente.
En estudios Serologicos, hematolgicos,
endocrinolgicos, oncologicos en los
transplantes. En M. forence y Antropologia.
Con propsitos mdicos se han utilizado en la
determinacin de hormonas y Proteinas Plasm.,
Ag tumorales, drogas, Ag y Ac de m.o.
parasitos, hongos, bacterias y virus.
Los resultadoselementos Dx, Info de Enfm. y
coadyuvan a la planificacin del Tto.
FUNDAMENTOS Y TIPOS DE ELISAS.

El ELISA se basa e el uso de Ag o Ac

marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad
tanto inmunolgica como enzimtica.
Al estar uno de los componentes (Ag o Ac)
marcado con una enzima e insolubilizado
sobre un soporte (inmunoadsorbente) la
reaccin Ag-Ac quedar inmovilizada
 Fcilmente revelada mediante la adicin de
un substrato especifico que al actuar la
enzima producir un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso
de un espectrofotmetro o un colormetro.
 Modelo analtico que depende de la Rx Ag-Ac
Determinacion de (Ag) o un (Ac) mediante el uso
de uno de ellos inmovilizado en fase solida y el
otro en solucin
Cualitativo, cuantitativo
Dependiendo del diseo se puede emplear Ag,
hatenos o Ac marcados con una enzima para
revelar Ag, Ac, hormonas o frmacos presentes
en fluidos corporales.
El producto de la Rx puede ser detectado y
cuantificado mediante marcador enzimtico con
un sustrato apropiado.
 PRINCIPIO BASICO
La Rx consiste: Al suero problema se le
agrega un conjugado que son Ac dirigidos
contra Ac especificos o Ag. Los cuales se
unirn a una enzima.
Las enzimas son capaces de modificar al
sustrato en presencia de un cromgeno
produciendo un producto coloreado que es
detectado visualmente o por
espectofotometria.
 TIPOS DE ELISA

Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sndwich
Doble (DAS)
Heterlogo (HADAS)
Antgeno marcado
ELISA competitivo
CARACTERISTICAS
Aalta Sensibilidad y Especificidad,Sencillo, bajo costo
reproducible y adaptable Versatil.
SENSIBILIDAD: expresa la capacidad de la tecnica para
detectar las menores concentraciones posibles de los
anticuerpos(o antigenos) buscados
ESPECIFICIDAD: expresa la capacidad de esta tecnica
para diferenciar los anticuerpos especificos(o antigenos)
buscados de otros presentes en el material de estudio.
Consigue mediante el uso de fase solida una separacin
fcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre.
Puede detectar sustancias en el orden de los
nanogramos y picogramos/ml
Automatizacion
 Poca cant. de muestra, suero problema (ul)
Enzimas de menor costo y seguras para el
operador
Menor tiempo
Mas estables, mayor periodo de validez
Pureza, estabilidad y cant del Ag
Pureza y calidad del Ac conjugado
PASOS GENERALES DE UN ELISA.

1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo.

2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de
antgenos o anticuerpos.
3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o
antgeno tapizado en el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o
anticuerpo no unido
5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no
unida
8. Adicin del substrato
9. Unin del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color
 Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden
resumir en dos grandes grupos:

ELISAs para detectar Ag: ELISAs sndwich.

ELISAs para detectar Ac: ELISAs indirectos.
LECTURA
DISEOS
COMPETITIVO
Con reactivo limitante, para dosificar partculas
pequeas con relativa pureza en una muestra y
pueden ser marcados con una enzima
Detectan Ac especficos independientemente de
su isotipo
 NO COMPETITIVO
Tambien llamado inmunometrico Reactivo en
exceso (Inmunopatologia de Enf. Infecciosas)
Detectan Ag y Ac
 FASE SOLIDA
Se puede utilizar 2 tipos de ustancias:
Las que favorecen la adsorcin fsica (por
fuerzas electrotaticas) de las mol. De Ag o
Ac: Poliestireno, cloruro de polivinilo,
polipropileno, nylon y silicona
Las que permiten fijacin covalente de eos
reactivos: Acrilamida, celulosa e
isotiocianato
Tubos, placas de microtitulacion requieren
menor cantidad de reactivos, muestra y son
aptas para la automatizacin
 INMUNOREACTIVOS
Clasificacion
Solubles: Proteinas, Glicoproteinas , CHOS y
Acidos Nucleicos: Unidos a fase solida
(Adsorcion)(Union covalente)(adsorcin-fijacin
Glutaraldehido)
Particulados: Celulas
 REACTIVOS
Ag
Por sensibilidad es necesario contar con un
Ag purificado y estable que asegure la
reproducibilidad
Ag parasitario= Mezclas complejas de
macromolculas inmunogenicas entre las que
se hallan Ag especficos y sust. Ag que
provienen del medio de cultivo o del husped
La puruficacion de Ag ha mejorado
sustancialemente con empleo de Ing.
Genetica, AcMo y sueros
 MARCADORES
Enzimaticos (Ps Alcalina,Peroxidasa)
Fluorescentes (Fluoroinmunoensayo)
Ligandos (Biotina, Avidina)
Luminiscentes (Luminoinmunoensayo)
Particulas (Liposomas)
Espectofotometria
Fluorescencia
Quimioluminiscencia (Luminol)
Electro-quimica
 ENZIMAS
Actividad especifica
Pureza
Estabilidad
Solubilidad
Facil medicin y deteccin
No se reduce la actividad por la conjugacin
Bajo costo
Estables en amplio intervalo de condiciones del
ensayo
Con grupos funcionales adecuados para su
accin Ac o Ag
 LAVADOS
Luego de la incorporacin de cada
componente (Ag-Ac conjugado, sustrato
enzimtico), debe efectuarse una serie de
lavados con el fin de eliminar el exceso que
no se le haya fijado (fsico-inmunolgico) al
sopsorte solido

Dependiendo del ensayo, habitualmente se

realizan de 3 a 6 en c/u de las etapas
 El tiempo tambin depende del ensayo
Como solucin se emplea buffer pH 7,2 que
tiene adems Tween 20, el cual facilita la
separacin de las sustancias actuando como
humectante, detergente y fungicida
INTERPRETACION CUALITATIVA
INTERPRETACION
CUANTITATIVA
 PRUEBAS
SEROLOGICAS
FIJACION DEL COMPLEMETO

www.lookfordiagnosis.com
JULES BORDET (1870-1961)
Naci en Soignies el
13 de junio de 1870.

La reaccin de
fijacin del
complemento --
(antes alexina)
descrita por Bordet
(fenmeno de
Bordet, o fenmeno
de Bordet-Gengou)
http://www.historiadelamedicina.org/bordet.html
FIJACION DEL COMPLEMENTO
Mtodo de eleccin para el Dx indirecto de
enfermedades infecciosas importantes en
veterinaria: brucelosis, paratuberculosis.

Posee alta especificidad y sensibilidad.

 Tiene como fundamento la utilizacin de una
cantidad precisa de complemento srico
(cobayo) se utiliza de manera total en
presencia de la reaccin de un Ag con su Ac
homologo.

www.scielo.org.co
Una segunda parte de la prueba consiste en:
una suspensin de glbulos rojos de carnero
(sensibilizados con Ac anti-globulos rojos) en
el complemento producen hemolisis del glbulo
rojo dando un fenmeno claramente visible.
 Si en la primera fase la reaccin del
complemento presente se utiliza, en la
segunda fase no hay complemento y el
fenmeno hemoltico no ocurre.
Pero si en la primera fase el complemento no
se utiliza porque no hay reaccin Ag-Ac el
complemento queda libre y se utiliza en la
segunda fase dando un fenmeno visible de
hemolisis.
http://es.slideshare.net/cocogonzalez790/brucelosis-46381424
 Son pruebas de tipo cuantitativas determinar
concentraciones del Ac

Son complicadas y de mayor duracin que otras pruebas

serolgicas. Se emplean en el Dx de algunas infecciones
(brucelosis, perineumona contagiosa virus respiratorio
sincitial etc.)
http://es.slideshare.net/bill12/pruebas-serologicas-14841066
INMUNOFLUORECENCIA
 Desarrollo de la
Inmunofluorecencia

1940

.
McDevitt,t , memorias biogrficas de la Academia Nacional de Ciencias

1954 Albert H. Coons

1912-1978
INMUNOFLUORECENCIA

Fluorocromo

Isotiocianato de fluoreceina
Isotiocinato de
tetrametilrodamina
MICROSCOPIO
Lente
ocular

Filtro Filtro de
Excitacin barrido
lmpara

Espejo
dicroico

Lente
objetivo
 Longitud de onda de Longitud de onda
Fluorocromo
absorcin (nm) de emisin (nm)

Cascade blue 422-430

374-403

Fluorescena
494 520
(FITC)

570
Rodamina (TRITC) 540

Naranja de
460-502 526-650
acridina

Yoduro de
536 617
propidio
 uso
Uso
INMUNOFLUORECENCIA

Directa Citometra de
Indirecta flujo
INMUNOFLUORECENCIA
DIRECTA FUNDAMENTO
Inmunofluorescencia Directa
INMUNOFLUORECENCIA DIRECTA

Ventajas desventajas

Amplificacin
Rpida mnima

Unin especifica Marcaje

duracion
APLICACIONES
RABIA
CAMPYLOBACTER
LISTERIA
CLOSTRIDIUM
MICOBACTERIUM
INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA
FUNDAMENTO
INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA
APLICACIONES
ViLeF
DISTEMPER
IBR
LEUCOSIS
RABIA
Sndrome Respiratorio y Reproductivo
Porcino (PRRS)
DEL VIRUS DE NEWCASTLE Y GUMBORO
Ventajas desventajas

Costo
Sensibilidad
Trabajo
No cultivos
personal
Rapida
 Citometra de flujo:

Anlisis de clulas
Ncleos
Cromosomas
mitocondrias
otras partculas en suspensin

Utiliza Ac monoclonales fluorescentes para la

deteccin de Ag de superficie celular mediante
un lser de luz que separa especficamente las
clulas marcadas.
UN CLITMETRO DE FLUJO
TIENE CINCO COMPONENTES
La celda de flujo laminar,.
Un sistema de medicin --los sistemas pticos.
Un sistema de iluminacin lmparas (Hg, xenn) lseres
(argn, criptn, tinturas), lseres (de argn ), lser
rojo de helio-nen , verde de helio-nen, ultravioleta de
helio-cadmio; lseres de diodo (azul, verde, rojo,
violeta).

Un detector y un conversor de
seales, ----computador.
Un sistema de amplificacin, lineal o
logartmico.
Un ordenador para el anlisis de las
seales
VENTAJAS
Rpida
Sencilla
Suficientemente sensible
Econmica
Fcil
 APLICACIONES
Si bien la citometra de flujo no se aplica mucho en veterinaria, su uso
en futuro cercano aumentar de manera considerable en la medida que
sea difundida la posibilidad de su aplicacin en otras especies distintas a
pequeos roedores

lupus eritematoso sistmico

identificacin precoz del rechazo en pacientes
que han recibido un trasplante
anemia aplsica
enfermedades inmunolgicas del pulmn
Leucemias
 BIBLIOGRAFIA
Lequin. R.M. Enzyme Inmunoassay (EIA),
Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay (ELISA),
Clinical Chemestry. 2005
Van Weemen, B.K. The Rise of EIA/ELISA
Clinical Chemestry. 2005
Yuan, Y.; Wang, W.; Chiou, N.-R.; Epstein,
A.J.; Lee, L.J. Design and Testing of a
Microfluidic Biochip for Cytokine Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay.
Biomicrofluidics 2009