UNIVERSIDAD POLITCNICA DE QUINTANA ROO

INTEGRANTES:
GLADIS DEL ROSARIOS CUPUL BALAM
ADALBERTO ZETINA AYALA
EDN LEN PREZ
ASIGNATURA: INGENIERA EN GENTICA
DOCENTE: JOB ALI DAZ HERNNDEZ
CARRERA: ING. BIOTECNOLOGA
GRUPO: IB6B

TEMA:
WESTERN BLOT

El Western Blot es una tcnica analtica usada para detectar una protena especifica en un extracto
crudo que contiene varias protenas, mediante el uso de anticuerpos. Los anticuerpos son protenas
producidas por el sistema inmune de un animal (inmunoglobulinas) que son capaces de detectar
protenas ajenas (antgenos) y unirse especficamente a ellas.

Esta tcnica es conocida tambin como Inmunoblot.

El nombre Western (oeste, occidental) le fue dado por el investigador W. Neal Burnette como un juego
de palabras por los nombres Southern y Northern de las tcnicas que se usan con el mismo fin pero que
son aplicadas a los cidos nucleicos. Luego que Edwin Southern diseara la tcnica que lleva su nombre
para detectar ADN, por oposicin se denomin Northern a la tcnica aplicada al ARN. Finalmente como
una broma, la tcnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para protenas fue denominada Western.

La transferencia de protenas o blotting supone la inmovilizacin de las protenas sobre membranas

sintticas, seguido de la deteccin empleando sistemas especialmente diseados para la tincin de
blots.

Es por ello que se usa el Western Blot en el que las protenas son separadas en primer lugar mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) y posteriormente
se transfieren a una membrana, mediante la aplicacin de un campo elctrico perpendicular al gel
(electroblotting). Una vez completada esta operacin la protenas de inters son reveladas por el
agregado de un anticuerpo especfico.

SDS-PAGE = sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (electroforesis en gel de

poliacrilamida con dodecilsulfato sdico).

De manera breve el Western Blot se lleva a cabo de la siguiente manera:

Las protenas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en funcin de su peso molecular
(se mide su peso en kilodaltons o kDa).

A continuacin se utiliza un anticuerpo especfico para detectar la protena de inters.

El resultado aporta informacin sobre el peso molecular de la protena y su cantidad relativa en la

muestra.

Cuales son los casos en los que es de gran utilidad utilizar el Western Blot?

Est la protena de inters presente en mi muestra?

El tratamiento con un determinado agente X, aumenta o reduce el nivel de expresin de mi

protena?

Cmo vara el nivel de expresin de la protena en distintos tejidos o lneas celulares?

Muestra es sana o patolgica? El WB permite detectar enfermedades tales como la enfermedad de

Lyme, la enfermedad de las vacas locas, el VIH, entre otras.

1. Preparacin de la muestra

Lisis: Las clulas o los tejidos se tratan con un tampn de lisis y seguidamente se degradan
mecnicamente para liberar las protenas.

Clulas: mantenerlas en hielo, lavar con PBS fro y aadir el tampn de lisis (~1ml por cada milln de
clulas). Despus agitar durante 30 minutos a 4 C.

Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente en nitrgeno

lquido y homogeneizar en tampn de lisis (300 l por cada 5 g de tejido). Aclarar las cuchillas del
homogeneizador con 2 x 300 8 Determinar la concentracin de protenas l de tampn, y agitar despus
durante 2 horas a 4 C.

Centrifugar a 4 C durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo en hielo.

Mantener las muestras en hielo o a 4C para evitar degradacin de las protenas.

Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en fro.

Antes de realizar la lisis, aadir al tampn un cocktail de inhibidores de proteasas.

Si la protena de inters est fosforilada, es importante asegurarse de incluir inhibidores de fosfatasas al

tampn de lisis.

Elegir un tampn de lisis adecuado en funcin de la localizacin celular de la protena de inters.

Determinar la concentracin de protenas.

Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente tratadas con agentes que
rompen las estructuras tridimensionales de las protenas (dmeros, estructuras terciarias)

Aadir el tampn de carga a la muestra y calentar 5 minutos a 95-100C o durante 5-10 minutos a 70C.

Un tampn de carga estndar contiene SDS (dodecilsulfato sdico) y -mercaptoetanol o DTT

(ditiotreitol):

El SDS desnaturaliza la protena en su estructura primaria y la recubre de cargas negativas.

El -mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los puentes disulfuro.

Todo ello permite que las protenas se separen en funcin del peso molecular mediante SDS-PAGE.

La reduccin y desnaturalizacin permiten adems la accesibilidad del anticuerpo a su sitio de unin.

2. Electroforesis en gel

El SDS-PAGE es un mtodo que permite separar las protenas bajo un campo elctrico de acuerdo a su
movilidad electrofortica.

El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el tampn de migracin. Un tampn

de migracin suele contener 25mM Tris; 190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3 Los lisados proteicos se
cargan en las calles del gel, normalmente entre 20 y 40 g por calle.

Se aplica un campo elctrico que provoca el movimiento de las protenas hacia el polo positivo.

Al haberse tratado las protenas con SDS (cargas negativas), las cargas SDS-PAGE funciona?
endgenas de las mismas son despreciables.

El resultado es que las protenas se separan en funcin de su talla, o peso molecular.

Las protenas de menor tamao quedan menos retenidas en la matriz del gel y por tanto migran mas
rpidamente.

Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de amonio (APS) y TEMED.

La estructura del gel puede modificarse alterando la proporcin de acrilamida.

Para protenas pequeas, se usa un gel con un porcentaje elevado de acrilamida, y viceversa para
protenas de gran tamao.

Los geles en gradiente se recomiendan en aquellos casos en los que el tamao de la protena es
desconocida.