PRCTICA 12

METABOLISMO DEL NITRGENO

PRUEBAS BIOQUMICAS:
Urea, Fenilalanina, MIO, LIA, Gelatina.

UREA
Determina la capacidad de un microorganismo de
hidrolizar la Urea en 2 molculas de Amonaco
(NH3) por la accin de la enzima ureasa, con la
resultante alcalinidad.
En solucin, la urea se hidroliza a carbonato de amonio como producto
final:

La ureasa es considerada una enzima constitutiva, ya que es sintetizada

por ciertas bacterias sin tomar en consideracin la presencia o ausencia
de sustrato (urea).

UREA DE CHRISTENSEN
(Agar con urea de Christensen)
FRMULA
Peptona
NaCl
Fosfato monopotsico
Glucosa 0.1%
Urea 20%
Rojo Fenol
Agar
Agua desionizada

1g
5g
2g
1g
20g
0.012g
15-20g
1L

Los microorganismos que hidrolizan la urea rpidamente pueden

producir reacciones positivas en 1-2hr; las especies menos activas
pueden requerir 3 das o ms.

UREA

+ tardo
NEG

+ tardo

FENILALANINA

FA PA

Determina la capacidad de un microorganismo

para desaminar la Fenilalanina a cido
fenilpirvico por va enzimtica, con la
produccin de acidez.
DESAMINACIN OXIDATIVA

FA o PA

pH final 7.3
La presencia de fenilalanina desaminasa se demuestra indirectamente detectando
el producto de su catlisis: el cido Fenilpirvico, ste se detecta agregando el
FeCl3 (solucin acuosa de cloruro frrico al 10%) el cual tiene 2 presentaciones:
Cloruro frrico acdico (RECOMENDADO)
FeCl3
12g
HCl concentrado
2.5mL
Agua desionizada llevar a: 100mL
Cloruro frrico no acdico
FeCl3
Agua desionizada

10g
100mL

FA o PA
El cloruro frrico forma un quelato de color verdoso entre el cido
fenilpirvico y los iones de Fe3+ esta reaccin se favorece en medio cido.
RESULTADOS:

NEGATIVO

+ POSITIVO

POSITIVO

MIO

Movilidad Indol Ornitina (semislido)

Determina la capacidad de un microorganismo de poseer motilidad
(movilidad), producir indol a partir de la degradacin de Triptfano
mediante la Triptofanasa y de descarboxilar la Ornitina mediante la
Ornitina descarboxilasa.

MIO

Microorganismo mvil:

a) Movilidad

Turbidez.

Microorganismo inmvil:
No se observa turbidez, en
la picadura solo crecimiento.

MIO
b) Indol
El indol es producido partir del triptfano por los microorganismos que
poseen la enzima triptofanasa.
En este medio hay dos fuentes de triptfano: la peptona y la triptena.
El pH ptimo para la accin de la triptofanasa es ligeramente alcalino (pH
7.4-7.8), una disminucin en el pH (acidez) disminuye la produccin de indol
y puede dar un resultado falso negativo o positivo dbil.

L-Triptfano

desaminacin

cido indolpirvico

Color ROJO +

Indol

Se detecta con el agregado de

Reactivo de Kovac o Ehrlich.

Alcohol isoamlico+ p-dimetilaminobenzaldehdo + HCl

MIO
c) Ornitina
La fermentacin de la Glucosa acidifica el medio, proporcionando las
condiciones ideales para la accin de la ornitina descarboxilasa, que al
descarboxilar la ornitina origina productos alcalinos con el consecuente
viraje del medio a morado.
INDICADOR DE pH: PRPURA DE BROMOCRESOL

pH cido AMARILLO = NEGATIVO.

pH alcalino MORADO = POSITIVO.

MIO
RESULTADOS
1

RESULTADOS.

M = Negativa
I = Negativa
O= Positiva

Movilidad

Indol

Ornitina

Negativa

Positiva

Negativa

Positiva

Negativa

Positiva

Positiva

Positiva

Positiva

AGAR HIERRO LISINA (LIA)

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismo, especialmente
Salmonella spp - basado en la descarboxilacin/desaminacin de la lisina y en la
produccin de cido sulfhdrico. Este medio pone de manifiesto: - Si la bacteria
posee la enzima descarboxilasa.
Componente

Funcin

Peptona de Gelatina 5g

Fuente de Nitrgeno

Extracto de Levadura 3g

Fuente de Vitamina (B)

Glucosa 1g

Fuente de Carbono

Citrato de Hierro y Amonio 0.5g

Indicador de H2S

Tiosulfato de Sodio 0.04g

Fuente de Azufre para produccin de H2S

L-Lisina 10g

Sustrato de Enzimas
Descarboxilasa/Desaminasa

Prpura de Bromocresol 0.02g

Indicador: Violeta (OH-) Amarillo(H+)

Agar 13.5g

Agente solidificante

 En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura

aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
descarboxilasa y desaminasa.
El citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio, son los
indicadores de la produccin de acido sulfhdrico.
El prpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de
color amarillo a pH igual o menos a 5.2 y de color violeta a pH igual
o mayor a 6.8.
Por descarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina,
que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al
color violeta.

 La descarboxilacion de la lisina, tiene lugar en medio cido, por

lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los m.o. que no producen lisina descarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la tonalidad del
medio de cultivo al amarillo, a las 24 hs de incubacin se observa el
pico de color violeta y debido al consumo de las peptonas el
fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el
ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de
hierro.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de
Morganella, desaminan la lisina.

DESCARBOXILACION Y
DESAMINACION

CADAVERINA
Es una diamina biognica que se obtiene por la
descomposicin del aminocido lisina. Se encuentra
principalmente en la materia orgnica muerta, y es
responsable en parte del fuerte olor a putrefaccin.
La cadaverina se forma por descarboxilacin de la lisina,
reaccin catalizada por la enzima lisina descarboxilasa :

RESULTADOS
DESCARBOXILACION DE LA LISINA
Prueba positiva: Pico violeta / fondo violeta K/K
Prueba negativa: Pico violeta / fondo amarillo K/A
DESAMINACION DE LA LISINA
Pico rojizo / fondo amarillo. R/A Esto sucede con cepas del
genero Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella spp.
PRODUCCION DE ACIDO SULFHIDRICO
Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio ( especialmente en
limite del pico y fondo).

K/K

K/A

K/A H2S

R/A H2S

Deteccin de enzima Lisina Descarboxilasa/Lisina

Desaminasa.

La enzima Lisina Descarboxilasa, descarboxila a la

Lisina generando un producto bsico, que deja el medio
de color purpura.
La Fermentacin de Glucosa cambia el fondo del tubo
a color amarillo.
La Desaminacin de la Lisina cambia el pico de flauta
a rojo (Proteus, Providencia, Morganella)

HIDRLISIS DE GELATINA
La produccin de proteasas es evaluada por
incorporacin de una protena (gelatina) a un
medio de cultivo.
Determinar la capacidad de produccin de la
enzima gelatinasa que licua de manera
irreversible la gelatina.

GELATINA

La gelatina se hidroliza en sus aminocidos

constitutivos.
Slido a T<25C.
Lquido a T >25C

PRUEBA DE LA GELATINA
Despus de incubar a 37C por 24 hrs. La gelatina en el
tubo se encuentra en estado lquido. Se coloca 10 min.
En agua fra y se observan los resultados.
Positivo: La gelatina permanece en estado lquido
Negativo: La gelatina regresa al estado slido

BIBLIOGRAFA

KONEMAN, E.W. [et.al.]. (2008). Diagnstico microbiolgico.

Buenos Aires: Medica Panamericana.

MAC FADDIN, J.F. (2003). Pruebas bioqumicas para la

idetificacin de bacterias de importancia mdica. Buenos Aires:
Medica Panamericana.

http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/miomedio.htm

http://
britanialab.com.ar/esp/productos/b02/fenilalaninagar.htm

http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/christensemed.htm