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U N I V E R S I D A D AU T N O M A D E N U E VO L E N

FA C U LTA D D E C I E N C I A S Q U M I C A S
DIVISIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO
Maestra en Ciencias con orientacin en
Farmacia

Pretratamiento de muestras
para tcnicas cromatogrficas
Tcnicas Instrumentales para la Investigacin

Q.F.B. Karla Josefina Santamara Lpez


Noviembre 2016

Resumen
Desarrollo

de mtodos para determinar drogas de abuso


fluidos biolgicos de muestras clnicas y forenses.

Importancia

de aplicacin de la tcnica de cromatografa


gas-lquido y espectrofotometra de masas en diferentes
tipos, con nfasis en la preparacin de muestras.

Se

han analizado y cuantificado efectivamente mediante


esta metodologa, anfetaminas, canabinoides, cocana,
morfina, fenciclidina, benzodiacepinas, antidepresivos
tricclicos, barbitricos, opiceos, anestsicos locales y
metadona.
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CL/EM-ESI
Empleado

para anlisis
general, confirmacin y
cuantificacin de 16 drogas,
en muestras de sangre.

Benzodiacepinas,

zopiclona,
zolpidem, metadona,
carisprodolo, merobamato,
carbamazepina y fenobarbital.

Lmites

de cuantificacin son
significativamente mas bajos
que los obtenidos en mtodos
convencionales
(inmunoensayos)

Mtodo

CG-EM

accesible, sencillo,
menos costoso y de alta
reproducibilidad, para
bsqueda de drogas de abuso
en fluidos corporales.

Anlisis

de muestras
mltiples.

Equipos

con banco de datos


para poder analizar el mayor
nmero de muestras en un
laboratorio.

Provee

de representacin
grafica de los datos fcil de
interpretar por el personal no
experimentado.

Preparacin de la muestra
Muestr
a

Introducci
n
muestra

Muestr
a

Mtodos
de
extraccin
de la
droga de
la muestra

CG

Preparaci
n de la
muestra

Introducci
n
muestra

CG

Muestras demasiado complejas,


demasiado diluidas o incompatibles con
el sistema cromatogrfico, impide su
introduccin directa.
Extraccin lquidolquido
Extraccin fase solida
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Equipos
Se

utilizaron dos equipos de CG-EM. Un Hewlett- Packard HP-5890


Serie I/EM 5971. Se us helio como gas portador y la presin de la
cabeza (head pressure) fue calculada usando el software RTL ;se
us palmitato de etilo como estndar para fijacin de tR (tiempo
de retencin de 17,68 min). El detector espectromtrico de masa
Agilent 5973 fue operado en el modo de scan (m/z 50500). Se us
tambin un Shimadzu 17 A/GP5000.

Anlisis en orina
ANLISIS DE ANFETAMINA/METANFETAMINA EN
ORINA MEDIANTE CG/EM USANDO EXTRACCIN
EN FASE SLIDA
1) Preparacin de la muestra: Se colocaron 3,2 mL
de orina en un tubo, se agregaron 32 L de HCl 5N y
estndar interno (EI; en ingls: IS), (EI sugeridos: d6anfetamina y d9-metanfetamina).
2) Siembra: Se cargaron 3,0 mL de muestra en la
columna a una velocidad de 2 mL/min.
3) Lavado de la columna: Se lav la columna de
extraccin con 2,0 mL de NaOH 0,1 N a una
velocidad de 2 mL/min, 2,0 mL de agua desionizada
a una velocidad de 8 mL/min, se purg con cnula
con 6 mL de agua a una velocidad de 30 mL/min y
con 4,0 mL de n-hexano a una velocidad de 8
mL/min.
4) Elucin: Se eluy con 3 mL de 2-propanol/cloruro
de metileno (75:25), a una velocidad de 2 mL/min.
5) Acidificacin: Se agregaron 100 L de HCl 1% en
metanol a cada tubo antes de evaporar.
6) Evaporacin: Se evapor el eluyente bajo
nitrgeno a 50 C.
7) Derivatizacin: Se agregaron 50 L de acetato de
etilo y 40 L de PFPA (anhdrido
pentafluorpropinico), se tap y se mezcl. Se hizo
reaccionar a 75 C durante 15 min y luego se
evapor a sequedad a 50 C. Se reconstituy en 50
L de acetato de etilo.

Preparacin de la
muestra
Siembra
Lavado de la columna
Elucin
Acidificacin
Evaporacin
Derivatizacin
Anfetamina/metanfetamina
Carboxi-thc
Cocana y benzolecgonina
Codena y morfina
6-monoacetil-morfina
Fenciclidina
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Preparacin general de muestras


ANLISIS DE MORFINA Y SUS
ANLISIS DE DROGAS EN SANGRE
METABOLITOS: GLUCURNIDOS, EN
HUMANA ENTERA POR EXTRACCIN EN
SUERO PORCINO POR EXTRACCIN EN
FASE SLIDA
FASE SLIDA
Se us un cartucho de extraccin de 1 mL/30
Se us un cartucho de extraccin de 1 mL/30
mg. Se acondicion con: 1 mL metanol/ 1 mL
mg. Se acondicion con: 1 mL metanol. Se
de agua. Se carg: 1 mL de sangre humana
equilibr con: 1 mL de agua. Se carg: 1 mL de
entera. Se lav con: 1 mL de metanol al 5%
suero porcino con EI. Se lav con: 1 mL de
en agua. Se eluy con: 1 mL de metanol. Se
agua. Se eluy con: 0,5 mL de trietilamina 3%
evapor y se reconstituy: se llev a 1 mL
metanol. No se requiri evaporacin: se
con metanol; se filtr con una membrana de
inyect la muestra directamente.
Anlisis de analgsico/narctico:
0,45 m
oxicodona
Anlisis de sedantes, clordiazepxido y
metabolitos
Anlisis de drogas en plasma
Anlisis de drogas, naltrexona, en plasma
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porcino

Preparacin de muestras headspace


MUESTRA DE ORINA
Una muestra de orina (5 mL) fue
transferida a un vial de headspace de
20 mL y se le agreg 1 mL de buffer
de acetato de amonio (1 M, pH 6,5).
Se agreg beta-glucuronidasa
(10 mL) de Escherichia coli K12 y la
mezcla fue termostatizada a 37 C
durante 90 min para la hidrlisis
enzimtica. La muestra se agit en la
muestra durante 60 min a 1.000 rpm.
La acilacin in situ de las muestras de
orina se realiz as: despus de la
hidrlisis con beta-glucuronidasa, se
agregaron 0,75 g de carbonato de
potasio y 0,5 mL de anhdrido actico.

MUESTRA DE SANGRE O DE BILIS


Una muestra de sangre o de fluido biliar (1 mL)
se
puso en un vial de headspace de 20 mL y se
agreg 1 mL
de buffer de acetato de amonio (1 M, pH 6,5). Se
agreg
beta-glucuronidasa (10 mL) de Escherichia coli
K12 y
la mezcla fue equilibrada a 37 C durante 90
min. Se
agreg metanol (1 mL) y se coloc la mezcla en
un bao
ultrasnico durante 15 min. La mezcla fue diluida
con 10 mL de agua bidestilada y el muestreo fue
realizado como con las muestras de orina.
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Resultados

Anlisis de
anfetaminas

SPME
Headspace

Headspce
convencional

CG/EM

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Tcnica
Considerada como una cromatografa, en laque
el objetivo es realizar la separacin de ciertos
componentes de una muestra
mediante su distribucin en dos fases una
estacionaria (solida) y una mvil (liquida)
Extraccin de fase
solida (SPE)

Procedimiento previo del anlisis, que


concentrar el analito de inters para su
posterior determinacin.

Ventajas
Permite la disminucin de solventes
Rapidez
Procesamiento simultaneo de un
mayor numero de muestras
Tcnica importante para fluidos
biolgicos, ambientales y alimentos
Se pueden utilizar pequeas y grandes
cantidades de muestra

Headspace

En el mtodo de espacio de cabeza se realiza


sobre el espacio superior al nivel de la
muestra, de esta manera se protege a la fibra
de compuestos de alto peso molecular, que
puedan daar a la fibra, el proceso
puede ser optimizado para temperatura y
grado de agitacin (mediante ultrasonido,
barra magntica etc). El muestreo por HS evita
que los residuos no voltiles de la muestra
entren en el Cromatgrafo

Desventajas
Limitada a muestras liquidas
La principal desventaja es que, en
determinadas ocasiones, el extracto final
no es compatible con el sistema
analtico, por lo tanto, el solvente debe
evaporarse y el residuo resuspenderse
en un solvente o solucin adecuada.
Esto limita su uso slo para analitos no
voltiles.

Se determinan compuestos voltiles y


semivoltiles

Procedimiento menos sensible que el


SPME/headspace

Precisin de inyeccin de muestra

Limitado para compuestos volatiles

Es una tcnica rpida y relativamente


sencilla
Micro extraccin en
fase
solida(SPME)/headsp
ace

Basada en la adsorcin de compuestos


orgnicos por una fase slida inmovilizada
sobre una fibra de slice fundida.
Permite concentrar eficientemente analitos
presentes en una fase lquida o gaseosa
(solvente slido)

No requiere solventes
Alta sensibilidad (ppt)
Existen diferentes fibras adsorbentes
disponibles en el mercado que
permiten cierta selectividad
Automatizacin que permite la

Limitada a muestras lquidas o


compuestos voltiles
Vida til de la fibra
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Conclusiones

Los fluidos biolgicos pueden considerarse entre las muestras ms sucias y/o complejas
debido a la gran cantidad de compuestos desconocidos que pueden contener. En consecuencia,
generalmente requieren la implementacin de todos los pasos de un pretratamiento.

Los sistemas de extraccin de muestra, permiten el procesado directo de muestras no-tratadas


dentro de matrices simples, tales como agua u orina, y algunas muestras slidas tales como
suelos

Para las muestras ms complejas (ejemplo: alimentos, suero, plasma, etc.), se requiere poco
tratamiento (extraccin lquido-lquido, precipitacin de proteinas) antes de SPE.

En este trabajo se dieron ejemplos varios de preparacin de muestras para el anlisis


confirmatorio de drogas de abuso, tales como: anfetaminas, opiatos, barbituratos, cocana y
metabolitos, benzodiazepinas, metadona y otros; los principales mtodos seleccionados de
pretratamiento consistieron en extraccin en fase slida con diferentes sorbentes y
microextraccin en fase slida con fibra de polidimetilsiloxano.

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La preparacin de la muestra es an un paso vital del proceso analtico


ya que asegura que las muestras sean adecuadas para la
determinacin cromatogrfica. Las tcnicas actualmente usadas
dependen del estado de agregacin de la muestra a ser analizada y de
la naturaleza de los analitos (ejemplo, volatilidad y estabilidad trmica).
Es de fundamental importancia la preparacin y/o la concentracin de la
muestra, y ms an el mtodo elegido para hacerlo, que tiene que ser
preciso y reproducible

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Bibliografia

Pomilio, Alicia Beatriz, & Vitale, Arturo Alberto. (2006). Tcnicas para determinacin cuali/cuantitativa de drogas de abuso en
fluidos biolgicos. Acta bioqumica clnica latinoamericana, 40(3)

Ortuo, J.C.(s/f). Aplicaciones de la Microextraccin en Fase Slida (SPME) en Cromatografa de Gases-Masas al anlisis de
productos crnicos[pdf]. Descargado de
http://www.grupobiomaster.com/documentos/5aplicaciones-de-la-microextraccion-en-fase-solida-al-analisis-de-carne-murcia
_1414048300.pdf

ETAPA PRE-ANALTICA: TRATAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA EXTRACCIN EN FASE SLIDA .[pdf].(s/f).


Descargado de http://www.fbcb.unl.edu.ar/catedras/analitica/doc/Apunte_Complementario_TP_11_EFS.pdf

Valls JP. Extraccin en fase slida ( SPE ) para tratamiento de muestras de alimentos para anlisis por cromatografa . 2004.

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