Western Blot

Qu es?

Es la combinacin electrofortica y procesos

inmunoquimicos.

Permite la deteccin especfica y semicuantitativa de las

protenas previamente separadas por una tcnica
electrofortica

Las protenas son transferidas desde el gel (poliacrimida)

a la membrana electroforticamente

Deteccin de protenas
especficas con anticuerpos

Pasos del wester Blot

Transferir las protenas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa

Coloracion de las proteinaspara confrmar la transparencia

Bloqueo de los sitios de unin inespecficos remanentes en la

membrana de nitrocelulosa

Incubacion con el anticuerpo especfico primario

Lavados del anticuerpo no unido

Deteccin del anticuerpo no unido utilizando anticuerpos conjugados

a perroxidasa de rabano picante (HRP)

Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccin con placas

radiogrficas

Paso 1

Las protenas se desnaturalizan

con calor, SDS y sustancias
como beta mercaptoetanol o
ditiotreitol que rompen puentes
S-S

El SDS aporta cargas negativas

Las protenas van a correr hacia

el nodo y se distribuirn de
acuerdo a su peso molecular.

Paso 2 Transferencia a la
membrana de nitrocelulosa

Las protenas separadas por tamao se

transfieren desde el gel a una membrana
de nitrocelulosa

La transferencia se puede llevar a cabo

en dos tipos de aparatos

1. Transferencia hmeda en aparatos que

poseen cmaras que se llenan de tampn

2. transferencia semiseca, en aparatos

que no tienen dichas cmaras y por lo
tanto no necesitan de dicho tampn

Paso 3 incubacin de
anticuerpos y revelado

Diagnstico

Procedimiento del blotting

1. Inmovilizacin de protenas sobre la membrana, por lo general por

electrotransferencia

esponja

 Se

utiliza para determinar la presencia y la

cantidad de antgenos y de anticuerpos
especficos.

Enla

actualidad es el estudio ms empleado para

el diagnstico de SIDA. Se emplean antgenos
virales obtenidos por cultivo celular

La deteccin de protenas sirve

para conocer:
1.

Niveles de expresin

2. Isoformas

3.

Modificaciones postraduccionales

4. Tiempo de vida media y degradacin

5. Localizacin subcelular