Reaccin Ag-Ac

eritrocitario y mtodos
de deteccin
UMT
L. Hernndez

Tipos de reaccin Ag-Ac

Aglutinacin
Hemlisis
Precipitacin

Aglutinacin
Agrupamiento de hemates que portan

un Ag en suspensin en un lquido que

tiene Ac

Hemlisis
Rotura de los eritrocitos con liberacin
de Hb. La hemlisis in vitro depende de
la presencia de Complemento.
No ocurre si el anticoagulante ha
quelado el calcio / magnesio: no se
activa Complemento

Hemlisis
Un sobrenadante rojizo puede indicar
hemlisis
Algunos Ac hemolticos in vitro causan
hemlisis intravascular in vivo: anti-Vel,
anti-Le, anti-Jka
Aspecto del suero tras
reaccin transfusional

Precipitacin
Se forma un complejo insoluble
cuando un Ac soluble reacciona con
un Ag soluble
En tubo se ven como sedimento
Requiere un proporcin ptima Ag/Ac

Factores que afectan

a la aglutinacin
La aglutinacin ocurre en dos fases
Sensibilizacin
Formacin de puentes entre las
clulas (aglutinacin)

Sensibilizacin
Se producen uniones dbiles y reversibles
Hay una relacin espacial Ag-Ac
Se puede incrementar mediante:
Agitacin
Centrifugacin
Variando las concentraciones
Variando el medio de solucin

Formacin de uniones
Uniones por puentes de hidrgeno
Uniones hidrofbicas
Uniones electrostticas (inicas)
Fuerzas de van der Waals

Fase 1: Efecto de la
temperatura
La mayora de Ac eritrocitarios
reacionan en rangos concretos de
temperatura:
Fros: 4-15 C
Calientes: 30-37 C

Fase 1: Efecto de la
temperatura
Los Ac que in vitro reaccionan slo
por debajo de 30 C raramente
causan destruccin eritrocitaria in
vivo y se consideran no significativos
clnicamente

Fase 1: Efecto del pH

El pH ptimo para que los Ac
significativos acten no se conoce
Se asume que se aproxima al pH
fisiolgico
Algunos anti-M reaccionan mejor a
pH cido

Fase 1: Efecto del tiempo de

incubacin
El tiempo que necesitan los Ag y Ac para
reaccionar es variable
En salino + antiglobulina: 30-60 min a
37C
Este tiempo se reduce a 10-15 min si se
usan soluciones potenciadoras: LISS, PEG

Fase 1: Efecto de la fuerza

inica
En medio salino, los iones de Na+ y Cl
-

neutralizan las cargas de los Ag y Ac

Reduciendo la fuerza inica del

medio se potencia la reaccin: LISS
Low Ionic Strength Solution

Fase 1: Proporcin Ag-Ac

Exceso de Ag: se reduce el nmero de
uniones entre eritrocitos = disminuye
aglutinacin
Exceso de Ac: preferible en la mayora
de casos

Fase 1: Proporcin Ag-Ac

Fase 1: Proporcin Ag-Ac

Proporcin utilizada: 2/1
2 gotas de suero (Ac)
1 gota de suspensin eritrocitos al 2-5%
(Ag)

Fase 1: Proporcin Ag-Ac

Si reducimos la concentracin de eritrocitos
(de 5% a 2%, por ejemplo) se duplica la
proporcin de Ac. Aadir 4 gotas de
suero a la suspensin de eritrocitos
A veces es til aadir hasta 10-20 gotas de
suero: en la investigacin de una reaccin
hemoltica

Fase 2: Aglutinacin
Una vez que las clulas se han
sensibilizado pueden aglutinar
Para ello las clulas deben
aproximarse entre ellas lo suficiente

Fase 2: Ac son IgG o IgM

Fase 2: Aglutinacin IgG

Cuando los Ac son IgG las molculas
no pueden aproximarse lo suficiente
para aglutinar
Hay excepciones, como los Ac anti-A,
anti-B, anti-M y anti-N

Fase 2: Aglutinacin IgM

Cuando los Ac son IgM las molculas s
pueden aproximarse lo suficiente para
aglutinar
Se produce una aglutinacin directa

Fase 2: potenciar
aglutinacin

Centrifugacin: las clulas se aproximan

Coombs indirecto: una molcula acta
uniendo las clulas que no pueden aglutinar
Albmina: produce deshidratacin
extracelular
Enzimas: reducen la repulsin entre clulas

Fase 2: Albmina
Acta reduciendo la repulsin entre
eritrocitos
Albmina bovina 22% o 30%

Fase 2: Enzimas
proteolticas
Bromelina, ficina, papana, tripsina

Reducen la repulsin entre eritrocitos

al disminuir las cargas negativas

Potencia la aglutinacin de algunos Ac
Pero destruye algunos Ag: M, N, S, Fy a,

Fyb

Fase 2: LISS y aditivos

El LISS aumenta notablemente la
sensibilizacin
Para prevenir la lisis, se aade glicina o
albmina
Problema del LISS: si se altera la proporcin
de Ag/Ac hay que variar la proporcin de LISS

Fase 2: otros
potenciadores
Polietilenglicol (PEG): aproxima las
clulas
Polibrene, sulfato de protamina, poli-Llisina: neutralizan las cargas negativas
(repulsin)

Prueba de Antiglobulina
1945: Coombs, Mourant y Race
describen un procedimiento para
detectar Ac unidos a eritrocitos que
no aglutinan

Prueba de Antiglobulina
Inicialmente se us para demostrar
Ac en suero
Posteriormente tambin para
demostrar eritrocitos recubiertos de
Ac o de elementos del Complemento

Prueba de Antiglobulina
COOMBS DIRECTO: demuestra sensibiliza-

cin in vivo de los eritrocitos (IgG o C3d)

AHAI
Hemlisis por frmacos
EHRN
Reacciones postransfusionales

Prueba de Antiglobulina
COOMBS INDIRECTO: demuestra reaccin in
vitro de los eritrocitos sensibilizados

Bases de la prueba
Antiglobulina

Todos los Ac son globulinas

Si a un animal se le inyectan, produce Ac

contra esas globulinas
Se elimina del suero animal aglutininas que
no interesan
El resultado es un suero que reacciona
especficmente contra las globulinas humanas

Bases de la prueba
Antiglobulina
Actualmente el suero se obtiene por otras
tcnicas (hibridomas)
El suero se puede obtener contra diversas
especificidades de globulina humana:
Poliespecfico
Monoespecfico: IgG, IgA, IgM, C3, C4
Subclases: IgG1, IgG3, C3b, C3d..

Bases de la prueba
Antiglobulina

Por qu hay que lavar? Para

eliminar globulinas libres en el suero

que pueden reaccionar con la
antiglobulina humana: falsos
negativos.

Bases de la prueba
Antiglobulina

El Control de Coombs: es preciso

aadir clulas con IgG en su superficie

cuando el resultado es negativo
(prueba cruzada, EAI).
Debe producirse aglutinacion = el
reactivo es realmente eficaz.

Otros mtodos: Adhesin a

eritrocitos en fase slida
Utilizan microplacas con Ag o Ac

Otros mtodos:
columnas
Tarjeta con microtubos
Los eritrocitos son filtrados por
centrifugacin en un medio que separa
los aglutinados de los no aglutinados

Otros mtodos:
columnas

Otros mtodos
Inmunofluorescencia
Radioinmunoanlisis
ELISA
MAIEA

De vuelta al tubo
Aglutininas inespecficas por el LISS:
paneles con todo positivo
Prueba cruzada en estos casos: con
albmina