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Biologa molecular

Transcripcin Reversa
Reaccin en Cadena de la Polimerasa
PCR y RT

Elaborado por: Armando Avils Hernndez, Paola Covarrubias


Coronado, Rossana Guirado Chvez, Ricardo Romero Arguelles, Rafael
Romero Clark, Keisy Gabriela Velderrain Daz.

Docente: Dr. Jos Guadalupe Soanes Organis.

FUNDAMENTO

Reaccin enzimtica in vitro.

Se basa en la actividad de la DNA polimerasa.

Se utilizan ciclos en donde se cambian las temperaturas durante


determinado tiempo.

Amplifica millones de veces una secuencia especifica.

Las tcnicas actuales empleadas


la
PCR
permiten
realizar
amplificacin a partir de 300 ng
ADNg, o bien desde 25 a 100 ng
el caso de ADNc.
0.3 a 1 M/reaccin
1 a 2.5 U/reaccin de PCR
1.0 y 2.5 mM
50 y 200M

Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales aumentan


la especificidad y fidelidad de la reaccin tales como el dimetilsulfxido
(DMSO) y detergentes como el tween 20 o el Tritn X-100.

en
la
de
en

Diseo de iniciadores y su papel en la especificidad de la PCR

La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud.


Los primers deben ser elegidos de modo que tengan una secuencia
nica dentro del DNA que ser amplificado.

Tambin debe evitarse un diseo que permita la complementariedad o la


formacin de estructuras secundarias inter e intra-primers, sobre todo
cuando estas estructuras secuestran el extremo 3.

En la actualidad, muchos programas computacionales


permiten el diseo semiautomatizado de los primers,
tomando en cuenta los parmetros mencionados. Algunos
de los programas utilizados son Oligo 6.0, Primer
Express, Primer Desing, etc.

La reaccin se lleva a cabo en termocicladores.

EXTRACCIN DEL DNA

Consiste en el aislamiento y purificacin de la molcula de ADN basado


en sus caractersticas fisicoqumicas.

Dos mtodos existentes: tradicionales y comerciales.

Homogenizacin del Tejido


y Lisis Celular

Tradicional

Comercial

Separacin de
Protenas y
Lpidos

Unin del DNA a una


Matriz y Lavado

Precipitacin del
DNA

Redisolucin del
DNA

Recuperacin del
DNA de la Matriz

AMPLIFICACIN
Desnaturalizacin: Separacin de las hebras de DNA.
(95C)
Alineamiento: los primers se alinean al extremo 3 del
templado previamente separado e hibridan con su secuencia
complementaria. (45-65C)
Elongacin: La DNA polimerasa acta sobre el complejo
templado-primers. (72C)

Equipos y soluciones para el anlisis

Preparacin del gel de agarosa al 1.5%

Se carga la muestra con ayuda de un buffer de


carga.

Los amplicones son visualizados a travs de una electroforesis en geles


de agarosa.

La cual consiste en una separacin de grandes molculas como los


cidos nucleicos a travs de una matriz solida que funciona como filtro
para separar las molculas de acuerdo a su tamao y carga elctrica.
Esta separacin se hace bajo un buffer tampn que puede ser TAE o
TBE.

Se agrega adems Bromuro de etidio, una molcula capaz de unirse al


ADN e doble cadena, al ser excitado con luz UV permite la visualizacin
de los ampliaciones en forma de bandas.

Cuando los amplicones son corridos en el gel, deben ser cargados junto
con un marcador molecular que contenga el nmero determinado de
segmentos de ADN conocidos.

La seal fluorescente es proporcional a la cantidad de

Aplicaciones PCR

Lneas de Investigacin

Genera grandes cantidades de templado para


secuencias
Genoma Humano
Mapeo de Cromosomas y cambios en la estructura
Marcadores Genticos
Secuencias de genes y Efectos de Variabilidad de la
secuencia en la funcin del cromosoma
Amplificar e Identificar las secuencias blancas in situ

Medicina

Enfermedades Hereditarias

Partiendo de una pequea cantidad de DNA genmico del paciente, se


pueden amplificar distintas partes de genes .

Tambin es un mtodo de deteccin si la mutacin afecta al tamao del


fragmento.

Pruebas de Paternidad

Se amplifica DNA de la madre, del hijo y de el/los padres

Pruebas legales (forense)

Identificacin mediante pruebas biolgicas

Amplificacin de muestras

Amplificacin de DNA vs Fingerprints

RETROTRANCRIPCION (RT)

REACCION PARA LA CONVERSION DE ARN EN ADNc