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Secuenciacin de ADN

Conocer la informacin para poder


usarla

Secuenciacin de ADN
Es la determinacin de la
secuencia de pares de bases
nitrogenadas en una regin
especfica de ADN de inters
Se realiza con el objetivo de
verificar si existe alguna variante
de lo que se conoce como
normal o comn en esa rea
especfica

Existen varios mtodos


Mtodo qumico, o
mtodo MaxamGilbert
Mtodo de
terminacin de
cadena, o mtodo
Sanger

Mtodo Maxam Gilbert


Se usa un medio qumico para
provocar la ruptura de la
secuencia en una pequea
porcin de sitios especficos del
ADN que se desea secuenciar
Los agentes qumicos utilizados
en cada caso son: DMS (G), cido
frmico (A+G), hidrazina (C+T) e
hidrazina ms sales (C).

Mtodo Maxan Gilbert

Mtodo Maxan Gilbert


G

A (+G)

T (+C)

Indique la secuencia

Indique la secuencia

Mtodo dideoxi o de Sanger


El mtodo dideoxi se basa en el
proceso de replicacin de ADN

Mtodo dideoxi
Usa
terminadores
de cadena,
nucletidos
dideoxi (que les
falta un segundo
oxgeno en el
carbono 3)
como parte de la
mezcla para la
reaccin de
replicacin

Mtodo dideoxi
Como resultado,
la reaccin de
replicacin se ve
detenida en el
lugar donde se
agrega un
dideoxinucletido
Esto da lugar a
una serie de
cadenas
detenidas en
diferentes puntos
http://www.rvc.ac.uk/Review/DNA_1/2_DN
A_Sequencing.cfm

Mtodo dideoxi
Con una
electroforesis puede
separarse estos
fragmentos
producidos, sabiendo
que los fragmentos
ms pequeos
viajarn a ms
distancia que los
mayores
Se ejemplific con un
tipo de nucletido
(C), pero se debe
repetir con cada uno
de los nucletidos (A,

Mtodo dideoxi
Al realizar la electroforesis con las cuatro
reacciones (una por cada nucletido), se
ve la cadena creciente de ADN,
dilucidndose as su secuencia original.

Mtodo dideoxi
Si se marca cada
dideoxinucletido o
su primer con
fluorescencia de
diferente color, la
reaccin puede
hacerse en un solo
vial y en un solo
carril de
electroforesis,
dilucidando la
secuencia por el
orden de los colores
de fluorescencia

Mtodo dideoxi

Mtodo dideoxi: electroforesis


especial
En el mtodo dideoxi se necesita
separar segmentos de ADN con
UNA sola base de diferencia, es
decir, se requiere de una ALTA
resolucin
Puede hacerse en poliacrilamida,
pero los geles para obtener
buena separacin son muy
largos

Mtodo dideoxi: electroforesis


especial

Mtodo dideoxi: electroforesis


capilar
La electroforesis capilar utiliza un
gel muy delgado y largo
Logra resoluciones muy buenas y
permite la visualizacin de todos
los dideoxinucletidos al mismo
tiempo, dando resultados mucho
ms fcil de interpretar

Electroforesis capilar: concepto


En la electroforesis capilar, la muestra
se ingresa al gel por el mismo campo
elctrico
Va movindose y separndose por
todo el capilar (longitud variable,
desde 22 a 80 cm)
Al llegar a la cmara de lectura, se le
hace llegar un lser y el detector
lee la fluorescencia que
emite cada
segmento
separado.

Electroforesis capilar, esquema

Mtodo dideoxi
El equipo va registrando el orden
de llegada de los segmentos, lo
cual se convierte en una
secuencia, segn el color
obtenido para cada uno

Secuenciacin, animacin y
video
Animacin:
http://dnalc.org/resources/anima
tions/cycseq.html
Video:
https://youtu.be/AV35C36bBto