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Diagnstico Micolgico

DR.. JAIME VARGAS ARZOLA

2016

TENDENCIAS EN EL DIAGNSTICO MICOLGICO


DIAGNOSTICO

MS RAPIDO

MS EFICIENTE

Tratamiento antifngico
IMPACTO CLINICO

DIAGNSTICO MICOLGICO
Diagnstico etiolgico frente a un cuadro
clnico sospechoso de micosis .

Estudio susceptibilidad antifngica in


vitro : Ej. Scedosporium
Informacin epidemiolgica :

Diferenciacin intraespecies : mtodos fenotpicos y


genotpicos.

DIAGNOSTICO MICOLOGICO : ETAPAS


Sospecha clnica
Toma y transporte de muestras clnicas
EXAMEN MICOLOGICO
- Examen microscpico directo
- Cultivo - Identificacin
Inmunodiagnstico
Histopatologa
Biologia Molecular

Toma y transporte de muestras clnicas

Sitios estriles : LCR, sangre,mdula sea, tejidos,


lquidos corporales, orina cateterizada

Sitios no estriles :
Muestras respiratorias ( expectoracin, aspirados traqueales,
cepillados y lavados bronquiales )
orina 2 miccin
lavados gstricos
piel, pelo, uas
heridas operatorias
Cavidad orofarngea , vagina, deposiciones

Examen
microscpico Diagnstico en tiempo real (menos de
directo
10 min )
Un informe rpido al clnico -inicio de
tratamiento.
Observar caractersticas morfolgicas
especficas.
Evidencia de infeccin - cultivo
negativo - Pacientes en tratamiento.

Estructuras fngicas
Hifas septadas hialinas ( 3-4 u) :. Aspergillus, Fusarium,
Paecilomyces
Hifas septadas pigmentadas( 3-4 u):.. Alternaria, Bipolaris
Curvularia
Hifas aseptadas ( 6-10 u) ......................... Zygomycetes
Hifas hialinas , septadas , artroconidios .......... Trichophyton
Esfrulas

.......................... Coccidioides

Clulas muriformes - cuerpos esclerticos .......Phialophora

Levaduras ( blastoconidios )
Levaduras encapsuladas ........................ Cryptococcus
Globosas
brotacin mltiple, base angosta ................... Paracoccidiodes
con base ancha .......................
Blastomyces
brotacin simple, con base angosta..........
Cryptococcus,Histoplasma
Ovoides

4- 7 u..................... Candida
2-3 u ......................Candida, Histoplasma, Sporotrix

levaduras intracelulares......................Histoplasma
levaduras , pseudohifas ................... Candida
artroconidios , blastoconido ,hifas ..................Trichosporon

EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO


Observacin al fresco : LCR
Levaduras redondas , sugerentes de C. neoformans.
Diferenciar de glbulos rojos, gotas de grasa .

Montaje

con solucin salina estril o agua

destilada
Observacin al fresco de secrecin vaginal : levaduras
y pseudohifas.

Examen microscpico directo


Mtodo : Tincin de Gram
Levaduras 3 veces ms grande que coccea .Gram +
Hifas : apariencia granular.

Utilidad : Detectar bacterias y hongos


Tiempo : 1 minuto

secrecin vaginal

Biopsia cerebral

Montaje con KOH ( 10-40% )

Material queratinizado .
Efecto clarificador.
No afecta las estructuras fngicas.
KOH : 10-40%
* Tinta parker
3:1
* DMSO - glicerol

Examen Microscpico directo


Mtodo : Tinta china o nigrosina
Deteccin cpsula C. neoformans en LCR
Tiempo : 1 min
Sensibilidad 50% no VIH ,
70-90% VIH

LCR

Blancocalcofluor
Tiempo : 1 min

Fluorocromo se une a residuos


Beta 1,3 de polisacridos como
celulosa y quitina de la pared de
la clula fngica y produce una
fluorescencia amarillenta o
verdosa.

Examen Microscpico Directo


Mtodo : Giemsa
Deteccin Histoplasma y P. jirovecci
Tiempo : 13-15 min

Examen Microscpico Directo


Mtodo : Plata metenamina- Gomori Grocott
Deteccin hongos en tejido
Tiempo : 60 min

Estructuras fngicas en muestras clnicas


SANGRE
Filamentos cortos ( raro )
Fusarium, Scedosporium, Paecilomyces,
Aspergillus
Levaduras
-Capsuladas : Cryptococcus
-No capsuladas : Candida, Trichosporon,
Cryptococcus
- no capsuladas intracelulares : Histoplasma

Hueso y Mdula sea


Levadura encapsulada......... Cryptococcus
Levaduras intracelulares...... Histoplasma
Levaduras grandes con brote de base ancha... Blastomyces
Cerebro
Filamentos cortos , clulas ovales, oscuras.... Exophiala
Filamentos largos
aseptados..............................Zygomycetes
oscuros.................................Ramichloridium
hialinos ...............................Aspergillus
Levaduras : Capsuladas ...............Cryptococcus
No capsuladas : Candida, Blastomyces

Examen microscpico directo


Limitaciones
Baja sensibilidad
Incapacidad de identificar el hongo a nivel de
especie ( en la mayoria de los casos )

Imposibilidad
sensibilidad.

de

realizar

estudios

de

Diagnstico rpido : 5-8 hrs


Tinciones histolgicas : micosis profundas
*Giemsa : Levaduras de Histoplasma capsulatum
*Gomori-Grocott : Especfica de hongos- color caf.
*Mucicarmin de Meyer:Cpsula de C. neoformans.

CULTIVO : Diagnstico en ms de 24 hrs


Mtodo ms utilizado
-identificacin de especie
-perfil de susceptibilidad antifngica
-caracterizacin genotpica.

Limitacin : lento
Velocidad de crecimiento del hongo.
Tiempo

Cultivo : Aislamiento Primario


Agar Sabouraud Glucosado
medio cido-pobre : glucosa, peptona,agar.
a)

Inhibir el crecimiento bacteriano: antibiticos- Cloramfenicol,


Gentamicina,Penicilina,Estreptomicina.
b) Inhibir el crecimiento de hongos saprfitos ambientales:
cicloheximida ( actidiona )
Agar Sabouraud Glucosado 2%
.

* Agar Mycosel - Micobiotic : Agar Sabouraud +

cloramfenicol+ cicloheximida.
* Agar Sabouraud + Brain Heart Infusion ( SABHI ) :
medio rico, hongos dimrficos, agentes de micosis
sistmicas.
* SABHI + sangre de cordero ( 5-10% ) : recuperacin de
Histoplasma capsulatum.

Agar Brain Heart Infusion

* Dermatophyte test medium ( DTM): medio selectivo


Recuperacin de dermatofitos- muestras muy
contaminadas- cambio de color .

* Lactritmel : medio casero : harina de trigo- leche-miel :


buena fructificacin - mejor evidencia de pigmentos.
Agar bird-seed - agar cido cafeico - medio selectivo
C. neoformans
Candida ID- CHROMagar- medio selectivo- Candida

Cultivo : Aislamiento secundario


Agar Sabouraud dextrosa 2% : hongos filamentosos
hialinos
Agar Papa dextrosa : hongos filamentosos.
Agar extracto de malta : hongos filamentosos y
levaduriformes .
Agar Czapeck- Dox : especies de Aspergillus y Penicillium.
Agar Malta : hongos levaduriformes.
Agar extracto de malta + extracto de levadura ( YM agar
) ...... Levaduras
Corn Meal Agar : levaduras.

Identificacin de hongos filamentosos


Aspergillus fumigatus

Criterios macro y
micromorfolgicos

Identificacin de levaduras

Caracteristicas micromorfolgicas y
fisiolgicas : asimilacin de azcares y otros
compuestos - 15 y 72 hrs.
Identificacin rpida por sistemas comerciales.
- Medios diferenciales : identificacin por
color y morfologa de las colonias Ej. medios
cromognicos .
- Tcnicas moleculares basadas en el anlis
de la secuencia del ADN .

Candida y diagnstico

......................
pero con otros hongos la
identificacin puede tardar mas de 1 mes

EL ESTUDIO MICOLOGICO NO
CONVENCIONAL CONSTA DE:

Estudio histolgico

Inmunodiagnstico

Tcnicas de biologa molecular

INMUNODIAGNOSTICO
Numerosos procedimientos serolgicos se han
empleado en el diagnstico de las diferentes
micosis.
Importante : estado inmunolgico del paciente,
en inmunodeprimidos puede existir una baja
respuesta de anticuerpos ------> detecta
antgenos.
Antgenos capsulares, de pared fngica y de
otros componentes especficos para cada hongo.

Deteccin de antgenos : pruebas sensibles


y una buena alternativa frente a cultivos que
requieren periodos de incubacin prolongada.

Deteccin de anticuerpos: IgG, IgM con

tcnicas de inmunodifusin o con tcnicas de


anticuerpos marcados ( deteccin indirecta)
- ELISA
- INMUNOFLUORESCENCIA
- WESTERN BLOT

Intradermorreaccin : Pruebas cutneas


Detecta infeccin pasada o presente

Micosis infeccin- Micosis enfermedad


Positivo > 5 mm.
Histoplasmina
Coccidioidina

Paracoccidioidina
Tricofitina

Pronstico
negativa positiva evolucin favorable
positiva negativa indica mal pronstico

0,05 ml de antgeno metablico


Lectura 48 hs
Ppula de 5 mm o + positiva

Tcnicas serolgicas
ANTIGENO

ANTICUERPO

Inmunodifusin en gel de agar ( DD)


- Contrainmunoelectroforesis( CIEF)
- Fijacin del Complemento
- ELISA
- Inmunofluorescencia
-

Antgenos utilizados
Histoplasma capsulatum

metablico (H y M)

Paracoccidioides brasiliensis

metablico (GP 43)

Coccidioides immitis

metablico (F)

3meses esttico 28C Smith

1 semana agitacin 37C PYG


15 das agitacin 28C

Aspergillus fumigatus

metablico

Aspergillus flavus

metablico

Aspergillus niger

metablico

Candida

somtico

40 das esttico 28C PYG


40 das esttico 28C PYG
40 das esttico 28C PYG

48 das agitacin 37C SDA

Inmunodifusin en gel de agar

Lectura de la prueba
Identidad

Identidad parcial

No identidad

Candidiasis
IDD
?

CIEF

Ag

_
Sospecha de candidiasis sistmica (muestras
seriadas)
seroconversin o aumento del nmero de bandas.
xito en la terapia antifngica
Disminucin o desaparicin de bandas
Se deben remover catteres, sondas o vlvulas
contaminadas

Aspergilosis
IDD
T
Ag

Una o ms bandas
de identidad con el
suero control
POSITIVO (100%
especificidad)
Reacciones
cruzadas: 90% de
los casos de
aspergilomas y en
el 70% de las
aspergilosis
broncopulmonar
alrgica

CIEF

Histoplasmosis
CIEF

IDD
H
T
Ag

M (70% de los

banda M forma aguda o


crnica, infeccin pasada
o prueba cutnea
reciente. Sola indica
infeccin precoz
banda H forma activa y
progresiva, no es
influenciada por la
histoplasmina, rara vez
aparece sola
banda H y M 10% de los
pacientes

pacientes)

Ambas bandas tienen valor semiolgico

Inmunofluorescencia

ELISA

ELISA

Ac especficos son adsorbidos a la placa.


Se une el Ag presente en la muestra.
Se lava y adiciona otro Ac especfico para este
Ag, que viene unido a una enzima que
cambiar el color del indicador coloreado

WESTERN BLOT

Inmunotransferencia en que se separan protenas por


electroforesis utilizando luego un Ac para determinar su
presencia y separarlas por tamao.
Luego se transfieren desde el gel de poliacrilamida a papel de
nitrocelulosa.
Posteriormente se aade un Ac especfico marcado y se obtienen
bandas caractersticas.

P. brasiliensis
97 Kda (M)

Gp 43

H. capsulatum

Enfermedad

Sensibilidad

Aspergilomas

90%

Candidiasis sistmicas no agudas

90%

Coccidioidomicosis

90%

Paracoccidioidomicosis

94%

Histoplasmosis

85%

Limitaciones de las pruebas


serolgicas
Capacidad de produccin de anticuerpos que
tiene el paciente
Tiempo de evolucin de la enfermedad (15-30 das)
Calidad de los reactivos
Errores en la ejecucin de las pruebas

Deteccin de anticuerpos
C.neoformans: sin utilidad diagnstica
Platelia Candida Ab/Ac/Ak: ELISA detecta
anticuerpos anti-manano en suero.
Resultado positivo: concentracin >10AU/ ml
Resultado negativo : < 5AU /ml
Tiempo: 3 hrs

Anticuerpos antimicelio de C. albicans .


Inmunofluorescencia indirecta
Suero ( adsorbido )
Tiempo: 2 hrs 10 min

Presencia de anticuerpos anti micelio a un


ttulo igual o superior a 160 es compatible
con Candidiasis invasora.

Deteccin de componentes no antignicos


-D-arabinitol : metabolito producido por Candida
albicans, C tropicalis, C parapsilosis y C kefir , puede
ser detectado en pacientes con candidiasis invasora
mediante cromatografa de gases espectrometra de
masas o un mtodo enzimtico comercializado.
- 3 Beta D glucano : componente de la pared celular
fngica que se libera durante la infeccin y puede
detectarse en el suero de pacientes con micosis .
- 2 sistemas comercializados : Fungitec G test y
Wako WB003.

Deteccin Antgenos
Ltex (LA)
Enzimoinmunoanlisis (EIA)
Anticuerpos fluorescentes (IF)
Pacientes inmunocomprometidos
oncohematolgicos, corticoterapia, trasplantados

Deteccin de antgenos
Antgeno capsular de Cryptococcus
neoformans.
Anticuerpos monoespecficos unidos a partculas
de ltex.

LCR, Suero.
Tiempo: 10-15 min
Sensibilidad 93-100%
Especificidad 93-98%

Falsos positivos : factor reumatoideo, lupus.

LECTURA DE RESULTADOS

diluciones

comenzar 1:2

Comenzar 1:128

Seguimiento de tratamientos es conveniente realizarlas con el


mismo equipo para evitar variaciones

Candidiasis invasora

ELISA, detecta manano en suero usando un


anticuerpo monoclonal EBCA1.
Reconoce residuos B-1,5 de manano de C.albicans,
C tropicalis, C glabrata,C guilliermondii, C
parapsilosis pero no de C krusei.
Resultado positivo : concentracin > 0.5ng/ml de
suero. - buena especificidad , baja sensibilidad.

Candidiasis
Sensibilidad
Pastorex Candida (LA)
mananos de pared celular 1991
Cand-Tec (LA)
Platelia Candida (EIA) 1999
citoplasmticos (enolasa) Dot
Beta glucan

Especificidad

26%

100%

77%

87%

40%

98 %

72%

100%

84%

87%

metabolitos (D-arabinitol) comatografa de gases,


espectrometra de masa, enzimtico

L a sensibilidad aumenta con el nmero de muestras

Aspergilosis invasora
ELISA detecta galactomanano de Aspergillus en
suero utilizando el anticuerpo monoclonal EBA2.
Reconoce galactomanano de A. fumigatus.A.flavus,
A.niger

Resultado positivo : > 1.5 ng


Pacientes hematolgicos

Deteccin de antgenos de
Histoplasma capsulatum (EIA)
(orina, LBA, suero y LCR)

Especificidad: 98%
Sensibilidad
Diseminada: Orina 92% suero 82%
HPP aguda: 44-75%
Primoinfeccin: 29-39%
Pulmonar Crnica: 14-21%
Meningitis: 40-67%
Reacciones cruzadas con B.dermatitidis, P. brasiliensis, y P. marneffei.
Histoplasmosis reference laboratory 2001

Utilidad de la serologa en el
diagnstico micolgico
Deteccin de
Anticuerpos Antgenos
Histoplasmosis
Paracoccidioidomicosis
Coccidioidomicosis
Aspergilosis
Candida
Criptococosis
Neumocistosis

SI
SI
SI
SI
SI
NO
NO

SI
NO
NO
SI
SI
SI
NO
Pontn J. RIAM, 2002

TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR


1. ESTUDIO CLONALIDAD
2. IDENTIFICACIN
PESQUISA
3. DE ESPECIE

Utilizacin de sondas ADN


diagnstico especfico poco sensible .

Diagnstico de Candidiasis vaginal


Ej. : Affirm VPIII
< 1 hora
Candida
S 75-82%, E 96-98%

BIOLOGA MOLECULAR
DIAGNSTICO

RESISTENCIA

EPIDEMIOLOGA Brotes IIH

Desafios: MICROARRAY
Basados en la hibridacin de fragmentos de cidos
nucleicos presentes en la muestra clnica con varios de
miles de oligonucletidos fijados en un soporte de vidrio.
Microchips con sondas
especficas de agentes
infecciosos
Pocillos Muestra
Reaccin Computador
Diagnstico directo de varios
agentes simultneamente

Una antigenemia
negativa no descarta
infeccin

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