UNIVERSIDAD NACIONAL SANTIAGO ANTUNEZ DE MAYOLO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

CULTIVO DE TEJIDOS INVITRO.

PONENTE. MSc. Neptal Daz

Len

CULTIVO DE TEJIDOS INVITRO.

Cultivo de tejidos viene a ser la propagacin rpida y masiva de plantas

idnticas a la planta original, a partir de cualquier parte aislada de sta, sean
estos: semillas, embriones, rganos, porciones de tejidos, pices meristemticos
o incluso clulas aisladas.
Y para ello es necesario adoptar procedimientos de asepsia para mantener los
cultivos libres de microorganismos patgenos.

INGREDIENTS..
Major salts (macronutrients)
Ammonium nitrate (NH4NO3) 1,650 mg/l
Calcium chloride (CaCl2 2H2O) 440 mg/l
Magnesium sulphate (MgSO4 7H2O) 370 mg/l
Potassium phosphate (KH2PO4) 170 mg/l
Potassium nitrate (KNO3) 1,900 mg/l
Minor salts (micronutrients)

Boric acid (H3BO3) 6.2 mg/l

Cobalt chloride (CoCl2 6H2O) 0.025 mg/l
Cupric sulphate (CuSO4 5H2O) 0.025 mg/l
Ferrous sulphate (FeSO4 7H2O) 27.8 mg/l
Manganese sulphate (MnSO4 4H2O) 22.3 mg/l
Potassium iodide (KI) 0.83 mg/l
Sodium molybdate (Na2MoO4 2H2O) 0.25 mg/l
Zinc sulphate (ZnSO47H2O) 8.6 mg/l
Na2EDTA 2H2O 37.2 mg/l

Vitamins and organics

i-Inositol 100 mg/l
Niacin 0.5 mg/l
Pyridoxine HCl 0.5 mg/l
Thiamine HCl 0.1 mg/l
IAA 130 mg/l
Kinetin 0.0410 mg/l
Glycine (recrystallized) 2.0 mg/l
Edamine S 1.0 g/l
Agar 10 g/l
An optimum pH of 5.8 should be maintained

VENTAJASDELCULTIVODETEJIDOS
Se cultiva en condiciones aspticas por lo que el material vegetal est libre de
virus, hongos, bacterias, nemtodos e insectos.
Asegura la estabilidad gentica, dado que en la micro propagacin se emplea la
propagacin vegetativa, no se produce alteraciones genticas porqu no ocurre
la polinizacin ni fecundacin.
Por medio del cultivo de tejidos, se logra reducir el tiempo de multiplicacin de
la especie en menos de un ao. Ej. palmeras que naturalmente requieren de 8 a
10 aos para producir semilla botnica.
Se puede programar la produccin en cualquier poca del ao, de acuerdo a la
disponibilidad de mano de obra, requerimientos del agricultor y semilleristas.
Ahorra espacio, en una pequea rea se almacenan miles de plantas.
Facilita el intercambio de material vegetal entre instituciones dentro y fuera del
pas, debido a que el material es sanitariamente limpio

DESVENTAJAS.

Los reactivos empleados en la preparacin de medios de cultivos son costosos

y poco disponibles en nuestro medio.
Algunos de los equipos empleados son costosos, por Ej. la cmara de flujo
laminar.
En la transferencia de las plantas del tubo de ensayo al medio ambiente (suelo)
hay que tener mucho cuidado por motivos de contaminacin.
El personal debe ser especializado, tener capacidad creativa con cualidades de
investigador.

DESCRIPCIONDELLABORATORIO.

a)readerecepcinoficina.
Es el primer ambiente ubicado al ingresar al laboratorio, se permite el ingreso a
personas que requieran informacin o desean realizar algn trmite documentario.
Cuenta con el siguiente equipamiento: Escritorio, sillas, colgadores, computadora,
estante de libros, material logstico.
b)readelavado,esterilizacinypreparacindemediosdecultivo.
Compuesto por 2 ambientes, en este cuarto se realiza el lavado de la cristalera y de
frascos provenientes del invernadero, se esteriliza el medio de cultivo, el material
de vidrio como placas petri, tubos y recipientes con material vegetal contaminado
utilizando el autoclave T 115C -135C.
Adems se prepara el medio de cultivo, se dispensa el medio en frascos, magentas
o tubos para luego ser esterilizados, se realiza la destilacin del agua, se almacenan
los reactivos, y materiales utilizados en la preparacin de medios de cultivo.

b)readelavado,esterilizacinypreparacindemediosdecultivo.
Laprimerasala,cuenta con los siguientes implementos: lavadero, detergente,
probetas de vidrio y plstico de diferentes tamaos, beakers, erlenmeyers,
frascos mostaceros, magentas, escobillas, baldes, guardapolvos, depsito de
agua y autoclave.

La segunda sala, cuenta con: equipo de destilacin de agua, gavetas para

cristalera, pesetas, goteros, matraz, probetas de vidrio, cocinilla elctrica,
reguladores de pH, solucin Buffer, pipetas, balanza de precisin, refrigeradora.

c) readesiembraydiseccin,Llamadatambindetransferencia.

En esta sala se encuentra la cmara de flujo laminar, donde se realiza la

diseccin de los segmentos de las plntulas, luego son sembradas en los
frascos que contienen el medio de cultivo slido.
Aqu todos los materiales deben estar esterilizados y el personal encargado de
la propagacin debe portar mascarilla, guardapolvo, guantes quirrgicos y
mangas de plstico, solo puede ingresar personal capacitado de la
propagacin.

d)readeincubacin.
En este ambiente se coloca el material ya propagado para que se desarrolle,
se controla la temperatura y la luz para cubrir las diferentes necesidades de
foto periodo (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad).
Esta rea se encuentra implementada de estantes de aluminio, con
instalaciones elctricas (fluorescentes de 40 W, de luz blanca de 3000 lux de
intensidad y un termmetro de mximas y mnimas, con temperatura de 18 a
22C.
Humedad relativa de 60 a 70 C. Fotoperiodo: 16 horas de luz y 8 horas de
oscuridad.

CAMARADEFLUJOLAMINAR.

La cmara de flujo laminar se usa en la micropropagacin,

proporciona una corriente de aire, la funcin de este equipo es de
purificar el aire y renovar el aire circundante en este ambiente. Antes
de realizar la micropropagacin se debe tener en cuenta:
Encender el equipo de 15 a 30 minutos antes de realizar los trabajos
con la finalidad de esterilizar el rea.
La cmara de flujo laminar es desinfectada en su interior con alcohol
de 96, as como los materiales que se emplean en la
micropropagacin tambin deben ser desinfectados y flameados,
antes de realizar cualquier corte de un explante.
Luego de terminar con el trabajo de micropropagacin, se limpia
nuevamente con alcohol de 96, y finalmente se apaga el equipo

Cmaras de flujo laminar

AISLAMIENTODEMERISTEMAS.
El meristema es un tejido compuesto de clulas que se dividen
rpidamente (clulas meristemticas) y constituyen el punto activo de
crecimiento de la yema vegetal.
Los tejidos vasculares ms diferenciados se encuentran alejados del
meristema., de all que las partculas de virus, que puedan estar presentes
en el sistema vascular demoran en llegar al meristema.
El aislamiento bajo condiciones aspticas del pice meristemtico, y su
cultivo en un medio asptico adecuado, conduce al desarrollo de
plntulas.

PASOSDELCULTIVODEMERISTEMAS.

Pasos.
Cortar un segmento de tallo con su respectiva yema (nudo) y eliminacin de las hojas.
Con una pinza, se remueve los segmentos en alcohol de 70 durante 30 segundos.
Pasar los nudos a la solucin de hipoclorito de calcio 2.5% durante 15 minutos y llevar a
la cmara asptica.
Enjuagar 3 a 4 veces en agua destilada, para remover residuos del hipoclorito de calcio
dentro de la cmara asptica.
Con el apoyo de un microscopio binocular para diseccin, el pice con dos primordios
foliares se corta y se siembra en el medio de cultivo.
Despus de 6 u 8 semanas las pequeas plntulas son trasplantadas a tubos ms grandes.

GRACIA
S