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CROMATOGRAFA

I N G . L A U R A V Z Q U E Z

CROMATOGRAFA
Fase estacionaria: slido o lquido fijado a un slido
Fase mvil: fludo (lquido o gas) que arrastra la muestra a travs de la
fase estacionaria

Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de


manera diferente con las dos fases establecindose un reparto
entre ambas

Se establece un equilibrio entre partculas adsorbidas y desorbidas

=
coeficiente de reparto

[molculas adsorbidas]
[mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]

FASE MVIL

FASE
ESTACIONARIA

Clasificaciones de cromatografa
1. Segn como se encuentre la fase estacionaria
a. columna

b. plana cromatografa en papel y en capa fina

2. Segn el tipo de fase estacionaria y fase mvil

Fase estacionaria

Fase mvil

Slida

Lquida o gaseosa

Lquido adsorbido

Lquida o gaseosa

3. Segn el tipo de flujo empleado


a. Gravedad

b. Capilaridad (papel, capa fina)

c. Fludo a presin (HPLC)

HPLC (high performance liquid chromatography)


Se basa en los mismos principios que la cromatografa a baja presin
Tiene mejor resolucin, tiempos menores, mejor reproducibilidad
El material empacado en las columnas est formado por pequeas
partculas de tamao muy uniforme y gran rigidez

Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presin

Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable


o vidrio grueso

FPLC (fast protein liquid chromatography)

Es una variante del HPLC con columnas y


equipamiento especialmente diseado para
separar o purificar protenas
Las columnas de FPLC soportan menos
presin que las de HPLC

4. Segn la finalidad del experimento

Separacin y purificacin

Separacin, cuantificacin y
caracterizacin

Preparativa

Analtica

4. Segn la interaccin entre la fase mvil y el soluto


a. Cromatografa de intercambio inico

carga-carga

b. Cromatografa de interaccin hidrofbica


c. Cromatografa de afinidad

efecto hidrofbico

variada pero especfica

d. Cromatografa de afinidad por metales


inmovilizados (IMAC)

e. Cromatografa de fase normal y reversa

enlaces covalentes

dipolos

Cromatografa de intercambio inico


La separacin se basa en diferencias de carga a un pH dado
Las interacciones son electrostticas
Dos tipos
Intercambio aninico: matriz cargada
positivamente (DEAE, TEA, QAE)
Intercambio catinico: matriz cargada
negativamente (carboximetilos,
sulfonatos, fosfatos)

Elucin: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza inica o


ambos

Aplicacin de la muestra

Condiciones iniciales
+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
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+ + +
-

+
+ + +
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+ + +
+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

Aumento en la concentracin de sales


+
+ + +
-

+
+ + +
-

Elucin de la protena de inters


+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
+ +
+
+
-

- + ++ +
+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

+
+ + +
-

Cromatografa de afinidad
Se basa en una interaccin biolgica especfica:
Enzima-sustrato
Anticuerpo-antgeno
Enzima-coenzima
Protena-ligando especfico
La elucin se puede lograr agregando el ligando (el que est unido a la
columna) en solucin o mediante cambios en el buffer que sean
capaces de debilitar la interaccin

IMAC (immobilized metal affinity chromatography)


Se basa en la formacin de enlaces de coordinacin entre iones
metlicos inmovilizados y grupos bsicos en protenas (histidinas)
Principalmente a los iones divalentes de metales de transicin
como Fe, Co, Ni, Cu y Zn

La elucin se lleva a cabo adicionando quelantes ms fuertes como el


imidazol a distintas concentraciones o cambios en el pH

Es muy utilizada para la purificacin de protenas recombinantes


Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo Nt o en el Ct

Cola de (Histidina)6

Ni2+

Cromatografa de interaccin hidrofbica


El soporte est sustitudo con cadenas alifticas de 2 a 10 carbonos u otros
grupos hidrofbicos
La interaccin es de tipo hidrofbica
La fase mvil debe tener una alta concentracin de sales
((NH4)2SO3 2 4 M)

Salting out
Para la elucin se disminuye la concentracin de sales en la fase mvil

Cromatografa de fase reversa


Est muy relacionada con la cromatografa de interaccin hidrofbica
pero son diferentes
El soporte est sustitudo por alifticas pero ms largas (8 -18 carbonos) y
la densidad de sustituyentes es mayor

La unin es ms fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no


polares para la elucin
Desnaturaliza protenas

Se utiliza en HPLC

Gel filtracin (cromatografa de exclusin molecular)


No es una cromatografa
La separacin se da por tamao

El gel debe ser inerte, de tamao de poro definido y sin carga

Mltiples aplicaciones:
Cambios de buffer
Separacin de molculas de bajo peso molecular de otras de mayor
tamao
Determinacin del peso molecular

Resultado final: cromatograma

Velucin (mL)

Velucin (mL)

y = unidades de absorbancia, unidades de fluorescencia relativa, intensidad


del pico (espectrometra de masa), entre otras

Concluyendo.
La pregunta ms importante

En qu son distintas las sustancias que deseo separar?