UNIVERSIDAD

NACIONAL AGRARIA
DEde
LA
SELVA y
Area
Reproduccin
Mejora Gentica

Facultad de
Zootecnia

Evaluacin de la
Calidad Seminal
Ing. M.SC. Jorge Daniel Jurez

IMPORTANCIA
Semen post colecta y antes de usarlo en la IA, debe
medirse cantidad y calidad sin afectar la viabilidad de
los SPZ (Cueto et. al., 1993).
La evaluacin debe ser realizada tan pronto como sea
posible post colecta (Evans y Maxwell, 1987).
Evaluacin elemento fundamental para detectar
infertilidad o subfertilidad de machos, producida por
diversos factores como: deficiencias alimenticias,
condiciones sanitarias, de manejo y ambientales.
Aplicacin en IA:
Gran impacto del macho en la eficacia reproductiva
de la explotacin.

IMPORTANCIA
Podemos valorar la calidad de dosis tras ser
sometidas a diversos procedimientos.
Se puede valorar in vivo o in vitro.
Mtodos para valorar la calidad seminal, para IA o
investigacin, en constante desarrollo para estimar con
mayor precisin fertilidad de machos reproductores.
Valoraciones de laboratorio no predicen con exactitud
la fertilidad, debido en gran parte a la subjetividad de
muchas de dichas valoraciones.
Mtodo ideal para analizar capacidad fecundante de
macho: estudio del semen y la capacidad de producir
gestaciones.

Calidad seminal
Depende de factores:
Intrnsecos: propios de cada animal.
Raza
Edad
Factores genticos: consanguinidad,
anomalas cromosmicas.
Patologas
Extrnsecos: manejo

Intrnseco
s:

Calidad semina
RAZA

Intrnseco
s:

Calidad semina
RAZA

Intrnseco
s:

Calidad semina
RAZA

Intrnseco
s:

Calidad semina
RAZA

Intrnseco
s:

Calidad semina
EDAD

Intrnseco
s:

Calidad semina
EDAD

Intrnseco
s:

Calidad semina
EDAD

Intrnseco
s:

Calidad semina
CONSANGUINIDA

Reproduccin en cautividad: cuando poblaciones naturales en

riesgo de extinguirse. Consanguinidad 1ras generaciones
inevitable, xito del programa de cra: evitar efectos deletreos
sobre supervivencia y reproduccin de individuos.
Animales en cautividad y domsticos, efecto ms
frecuentemente de consanguinidad detectado: aumento en
mortandad juvenil (Ralls et al., 1979; Ralls y Ballou, 1986;
Mitton, 1993).
Machos Gazella cuvieri con > nivele de consanguinidad tienen
peor calidad seminal que de otras especies (Cassinello et al.,
1998): Disminucin en proporcin de spz mtiles, y de spz
morfolgicamente normales, y de spz con acrosoma intacto,
importantes en la capacidad fecundante de spz (Roldan et al.,
1998), > dao en ADN > mortalidad.

Intrnseco
s:Virales:

Calidad semina
INFECCIOSAS

A nivel testicular, barrera hemato-testicular mecanismo

para evitar defensa y posibles tratamientos, reservorio
para virus y otros agentes infecciosos.
Herpes virus bovino (BHV-1) causa Rinotraqueitis bovina
infecciosa (IBR) en semen de toros sub clnicamente
infectados y seronegativos.
Diarrea viral bovina (BVDV ) Transmitido en semen (alta
concentracin), no alteracin en morfologa. Sobrevive a
criopreservacin, infeccin en hembras, en novillas: fallas
en concepcin y permite mayor difusin del virus.

Intrnseco
s:

Infecciosos no virales

Calidad semina
INFECCIOSAS

Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

eliminado por semen y aislado de rganos
reproductivos de toros infectados; no est determinado
si semen puede o no transmitir la enfermedad va
uterina.
Leptospirosis importante causa de infertilidad en
bovinos: L. interrogans, borgpeterseneii y kirschneri.
Otros agentes infecciosos: PI3 (Parainfluenza 3),
Trichomona f, Campylobacter f, Brucella, entre otros,
los cuales afectan de una u otra forma la calidad
seminal,

Intrnseco
s:

Infecciosos no virales

Calidad semina
INFECCIOSAS

Conteo total de unidades formadoras de colonias

(UFC) por mL en semen fresco y congelado.

Factores
Extrnsecos

Calidad semina

Dependen del ambiente de la

explotacin y del manejo del macho.
Factores:

Ambiente

Frecuencia de extracciones

Estrs

Alojamiento (confort)

Nivel sanitario

Alimentacin

Otros factores

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Ambiente

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Ambiente

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Ambiente

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Frecuencia de
extracciones

Influencia de la
frecuencia
de
recoleccin en el
nmero de dosis
producidas por
eyaculado.

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Frecuencia de
extracciones
Los promedios indican
que al aumentar el N
de recolecciones, el
volumen de eyaculado
disminuye 20% en las
frecuencias de dos y
tres veces por semana,
con
reducciones
mayores si es extrado
todos los das (P<0,01).

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Estrs

Principal mecanismo del estrs da lugar a inadecuada

calidad seminal: hormona CRH factor liberador de la
hormona
corticotropa
(ACTH):
desencadena
cascada del estrs con acciones de tipo inhibitorio a
nivel testicular como central con inhibicin de la LH.
CRH secretado a nivel hipotalmico, en estres
tambin por Leydig a nivel testicular (iniciado por
Serotoninas), actuando en receptores en membrana
de las Leydig como potente regulador negativo para
LH. As impide la produccin de andrgenos.

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Alojamiento

Verracos no deben estar juntos, por agresiones fsicas.

Area de 6 m2 mnimo, altura 1.4 m.

Preferible en cuadras, prolonga vida del macho y

disminuye problemas de aplomos.

Preferible contacto visual y nasal entre verracos,

mejora lbido.

Suelo enrrejillado, cama de paja de buena calidad,

efecto positivo en calidad seminal, aumenta motilidad y
disminuye formas anormales (Corcuera et. al., 2001)

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Alojamiento

Condiciones ambientales:
T optima: 16 22C, conveniente que nunca pase los
29C da estrs trmico, afecta libido y produccin
seminal.

H recomendada: 65 75% con una velocidad del aire

de 0,2 0,7 m/s.

Fotoperiodo:
Exposicin de verracos a periodos de 12 horas con
intensidad de 300 luxes.

Preferible luz fluorescente.

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Alimentacin

Animales con dietas balanceadas: ms precoces que

subalimentados.

Machos subalimentados retraso en pubertad: al

disminuir produccin de IGF-1 y, retarda pxn de LH y
T4.

Dietas balanceadas con pastos ricos en energa, y

adecuado % protena, benficas en inicio de
pubertad: desarrollo testicular ms rpido, mejor
entre 10 y 15 m.

Desnutricin atrasa inicio de pubertad, y dietas no

balanceadas por exceso (sobrecondicionamientos),
llevan a alteraciones irreversibles, a nivel fsico como
de calidad espermtica.

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Alimentacin

Efectos indirectos de sobrealimentacin como

obesidad y problemas de pezuas y patas tambin
pueden contribuir a una menor libido.

Siempre es conveniente suplementar la racin con

golpes vitamnicos y de minerales A, C, D, E, Biotina,
Zn, Se, otros) peridicamente, segn ritmo de
recogidas, poca del ao, y estado de carnes.

Factores
Extrnsecos

Calidad semina
Nivel sanitario

Personal que trabaja con machos debe ser distinto al

resto del laboratorio. Si no es posible, debe tener de
ropa especfica, distinto material y previa ducha.

Enfermedades, trastornos o vacunaciones, que dan

lugar a fiebres, efecto negativo similar a los producidos
por estrs trmico:

Drstico aumento del % de clulas anormales.

Por eso no suele vacunarse a los machos el mismo

da, eso si se piensa que puede causar problemas de
fiebres.

Contrastacin seminal
Caractersticas que debe reunir una buena
prueba laboratorial:
Objetividad
Repetibilidad
Precisin
COSTE ACEPTABLE

Valoracin de la calidad seminal:

espermiograma clsico
Macroscpica:
Color: opaco a lechoso
Volumen: por especie
Olor: tpico x sp.
pH: neutro
Microscpica:
Concentracin
Motilidad
Morfoanomalas
Valoracin de los acrosomas

Contrastacin
microscpica:
Concentracin
Nmero de espermatozoides/mL.
espermtica
Es importante porque permite rentabilizar el
nmero de dosis obtenidas/eyaculado.
Instrumentos de medida:
cmaras de recuento celular,
espectrofotmetros o colormetros,
contadores celulares electrnicos o
programas computorizados de anlisis
seminal (CASA)

Contrastacin microscpica:
Motilidad Espermtica.
Correlacin con la fertilidad poco clara
Medida:
subjetiva,
sistemas computarizados (CASA)
Otros: migracin en moco cervical
Motilidad subjetiva:
Masal
Individual

Contrastacin microscpica:
Motilidad Espermtica.
Motilidad masal: semen no diluido. Valora el
nmero, la densidad y la velocidad de movimiento
de las ondas o remolinos que se forman en la
superficie de la gota de semen. Poco usada.

Contrastacin microscpica:
Motilidad Espermtica.
Motilidad individual: semen diluido. Valora la cantidad
y la calidad del movimiento. TEMPERATURA!

Contrastacin microscpica:
Motilidad Espermtica.

Motilidad Espermtica.
Prueba en porcino:
Eyaculados aptos:
>75% motilidad
total, >65%
mviles
progresivos.
> 70% para
evitar problemas
de fertilidad y
prolificidad

Contrastacin microscpica:
Motilidad Espermtica.
Sistemas CASA (Computer Assisted Sperm
Analysis):

Estimacin del porcentaje de motilidad

de forma objetiva.
Informa acerca del % de spz mtiles de

la muestra y de la calidad del movimiento.

Sistemas de anlisis de imagen, dan

resultados acerca de las caractersticas

del movimiento.

Sistemas CASA (Computer Assisted Sperm

Analysis):

Sistemas CASA (Computer Assisted Sperm

Analysis):

Velocidades
VCL: curvilineal path velocity. Velocidad media
del espermatozoide medida sobre la trayectoria
verdadera punto por punto (m/sec).
VSL: Straight line velocity. Distancia en lnea
recta entre el inicio y el final de la trayectoria del
espermatozoide (m/sec).
VAP: average path velocity. Velocidad sobre
una trayectoria calculada y recta (m/sec).
Trayectoria general del espermatozoide

Sistemas CASA (Computer Assisted Sperm

Analysis):

Sistemas CASA (Computer Assisted Sperm

Analysis):

Sistemas CASA (Computer Assisted Sperm

Analysis):

Motilidad
Penetracin de moco cervical.
Usado sobre todo en humana.
Funciones del moco cervical?
Qu problemas puede presentar este test?
Medios sintticos con poliacrilamida o
Metilcelulosa.
Usado en vacuno tambin.

MOORRFFOOLLOOGG AA
M
Relacionado con la forma de los spz, el anlisis permite
detectar problemas en espermatognesis y en maduracin
epididimaria.
La fertilidad se reduce cuando las anormalidades
superan el 18 al 20%. En especies politocas, tambin
desciende la prolificidad.
Anomalas causan alteraciones para la interaccin entre
gametos o produccin de embriones inviables.
Spz normales: 3 regiones principales (cabeza, pieza
intermedia y cola), dimensiones determinadas.
Morfoanomalias: Cabeza, Cola y Acrosomas

MOORRFFOOLLOOGG AA
M
Cabeza:
Asimtrica
Piriforme
Afinada
Corta
Micro
Gigante

Cola:
Abaxial
Tirabuzn
Filiforme
Enrollado
Doble
Proximal
Translocada
Distal
Doblada

Acrosomas:
Incompleto
Anudado
Arrugado

MOORRFFOOLLOOGG AA
M

MOORRFFOOLLOOGG AA
M
Tinciones: gran cantidad:
eosina-nigrosina,
rojo de bengala,
Azul de victoria,
Wells,
Williams,
Giemsa,
tinta china,
Fuchina Fenicada,
violeta de metilo,
anilina,
coloracin de Karras,
Por lo comn se cuentan
entre 200 300 spz en varios
campos.

MOORRFFOOLLOOGG AA: : TTi ippooss

M
Malformaciones en eyaculado se clasifican en funcin del
lugar de origen: primarias, secundarias y terciarias.
Anomalas primarias: desarrolladas en testculo, defecto
en la espermatognesis o espermiognesis. No deben
exceder del 5%, determinantes de baja fertilidad.
Especficas: de origen gentico, pueden afectar a
cualquier estructura del spz.

No especficas: se dan alteraciones de:

la cabeza: macro o microcfalos, cabezas
alargadas, piriformes
la pieza intermedia: pieza intermedia doble,
engrosada
la cola: cola corta, colas dobles

Anormalidades
Primarias:
normalidades Primarias:
De
Cabeza:

Anormalidades
Primarias:
normalidades Primarias:
De La Pieza
Intermedia:

De La
Cola:

MOORRFFOOLLOOGG AA: : TTi ippooss

M
Anomalas secundarias: producidas durante maduracin
de spz en el epiddimo.
Extremo distal enrollado.
Cola enrollada completamente o parcialmente.
Cabeza sin cola.
Cola en ltigo (alteracin en la eliminacin de la gota
citoplasmtica o por secrecin alterada de las glndulas
accesorias).
Estos defectos no estn considerados como serios y
no afectan la fertilidad a menos que sea mayor del 15%
(MUOZ y PAUCAR, 2005).

AnormalidadesSecundarias:
Secundarias:
Anormalidades

MOORRFFOOLLOOGG AA: : TTi ippooss

M
Anomalas terciarias: por mal manejo del semen en
el laboratorio. Pueden ser:
Mecnicas.
Fsico-qumicas.
Pueden confundir con alteraciones secundarias.
Dentro de ellas:
Colas en ltigo: alteraciones de osmolaridad,
cambios bruscos de temperatura.

Cabezas sin
extensiones

cola:

mala

realizacin

de

MOORRFFOOLLOOGG AA
M
Niveles tolerables de morfoanomalas (Barth y Oko, 1989).
Anomalas nucleares: < 15-20%. fallos de fecundacin o
desarrollo embrionario.
Anomalas de acrosoma o flagelo que no interfieren con
la capacidad de spzs normales fecunden ovocitos: 25%.
Spz normales: 75%.
Spz con gota citoplasmtica proximal: < 30%
Spz inmaduro ms frgil que maduro, se observa
fracturas ceflicas (transversales o longitudinales) y de
cola.
Origen de morfoanomalas: sobre todo las secundarias y
falta de maduracin de Spz, por reduccin del flujo de T4
a nivel testicular, se da por estrs o ritmos de extraccin
inadecuados, por exceso o por defecto. Tambin pueden
tener
origen
: presencia
de gentico,
varicocele.
Pronstico
deanatmico
recuperacin
de origen
presentes

de forma permanente

Anlisis morfolgicos
Morfometra.
Estima variaciones en la forma de los spz (cabeza),
podra indicar defectos en la condensacin de la
cromatina.
Caballos y verracos subfrtiles: cabeza de mayores
dimensiones.
Cambios en dimensiones de la cabeza tras
congelacin.
Medidas de la cabeza de spz de toros o moruecos
frtiles es poco variable.
Establecer las condiciones ptimas para el anlisis.

Aglutinacin
Consiste en la unin de varios spz formando acmulos.
Se valora observando diversos campos en m.o. con
objetivo 10x y 40x, considerando el porcentaje de campo
que ocupa; normal entre 0 y 10%, con valor lmite del 25%.
Existen varios tipos de aglutinacin segn el origen y el
estado de los espermatozoides:
1. Aglutinacin verdadera: Los spz estn vivos.
a. Aglutinacin
bioqumica:
Producida
por
alteraciones en la composicin de protenas y
minerales del plasma seminal (relacionado con
inflamaciones y/o infecciones de glndulas anejas) o
prdida de algunas protenas que recubren la
superficie del spz.

Aglutinacin
b. Aglutinacin inmunomediada: Debida a un fenmeno de
autoinmunidad en el que el propio verraco elaborara anticuerpos
contra sus espermatozoides, atrapndolos y aglutinndolos.

2. Aglutinacin falsa: Los spz estn muertos. La ms

frecuente denominndose as a la simple acumulacin de
spz muertos. Esta puede aparecer relacionada con
cualquier alteracin que afecte a la dosis espermtica,
como puede ser la presencia de txicos o contaminantes.
As se consideran varios grados:
* GRADO 1: Un grupo de menos de 20 spz.
* GRADO 2: Dos grupos de menos de 20 spz.
* GRADO 3: Varios grupos de ms de 20 spz.

Aglutinacin
Grado de aglutinacin:

Puede ser valorado cualitativamente (+/++/+++),

cuantitativamente (1/2/3). Todos los verracos presentan
algn tipo de aglutinacin.

GRADO 1:
Un grupo de
menos de 20
spz.

GRADO 2:
Dos grupos
de menos de
20 spz.

GRADO 3:
Varios grupos
de ms de 20
spz.

Aglutinacin

Acrosomas
Se evalan: M de contraste de fases, m. con contraste
interferencial, m.e.
Vlida para especies con acrosoma grande.
Tinciones:
campo claro (Giemsa, eosina B-Fast green FCF;
naftol amarillo y eritrosina B). Problemas en spz
congelados.
o fluorescencia (FITC-PSA, FITC-PNA, PE-PNA,
Lysotracker, anticuerpos marcados). Las tinciones
fluorescentes se pueden evaluar tambin mediante
citometra de flujo).

Acrosomas
Observaremos cuantos spz poseen su acrosoma intacto
y cuantos lo tienen daado, lo estn perdiendo o lo han
perdido.
Se contabilizarn como ntegros o daados.
Valores normales: >80% de acrosomas intactos
Valor lmite: 60%

Acrosomas

Spz teidos con una tcnica triple tincin simplificada.

1. Spz vivos con acrosoma reaccionado.
2. Spz muerto con acrosoma intacto.
3. Spz muerto con acrosoma reaccionado degenerado.
4. Spz vivo con acrosoma intacto.
5. y (6)Spz vivo con acrosoma parcialmente intacto.

Viabilidad espermtica.
Integridad de las mbs plasmtica y acrosomal externa.
Triple
Tinci
n

Flourocromo

BP

SYBR-14

525

MbP ntegra (vivos), se liga al ADN.

IP

620

Prdida de integridad MbP (muertos), se liga al ADN.

PE-PNA

575

Con prdida de integridad de MbA externa.

A:
Poblacin
con
prdida de integridad
de la MbP.
B:
Poblacin
con
prdida de integridad
de la MbP y MbA
daada.
C: Poblacin con MbP
integra y MbA daada.
D: Poblacin con MbP
integra.

Uso

IP +
SYBR PE-PNA -

B
IP +
SYBR PE-PNA +

IP SYBR +
PE-PNA -

IP SYBR +
PE-PNA +

Pruebas funcionales
Evaluacin de la integridad de la MbP.

Tinciones vitales: integridad estructural

HOST (test de endsmosis): funcionalidad de
la MbP.
Test de resistencia osmtica (ORT)
Test de resistencia trmica.
Evaluacin del funcionamiento de las
mitocondrias.
Estudio de los procesos de capacitacin y
reaccin acrosmica.
Integridad y estructura de la cromatina

Pruebas funcionales

Integridad de la membrana plasmtica

Tinciones de campo claro:
Eosina/nigrosina
Eosina B/fast green (FCF): no funciona con
semen de verracos
Eosina/anilina azul
Tripn azul, rojo congo (uso en tinciones
vitales/acrosomas)
Tinciones fluorescentes:
SYBR14/IP
Hoechst 33258, DAPI
Bromuro de etidio, hidroetidina
CFDA (6-carboxifluorescein diacetato)/IP
YoPro-1, etc

Pruebas funcionales

Integridad de la membrana plasmtica

Funcionalidad espermtica.
Estabilidad de la membrana plasmtica o desorden
lipdico.

Flourocromo

BP

Permeabilidad

M540

620

Identifica el desorden lipdico en la MP.

YP1

525

Identifica la prdida de integridad MP.

A: Poblacin con prdida de integridad de la mb. Plasmtica

(noPoblacin
viable) viable con mb. Plasmtica inestable
B:
(exteriorizacin
PS).
C:
Poblacin conde
mb.
plasmtica integra (viable).

No Cap

Cap

Pruebas funcionales

Integridad de la membrana plasmtica

Por comportamiento de spz frente a variaciones

osmticas, se determina el estado de la MbP, mediante
dos tcnicas:

Test de endsmosis celular (HOST).

Test de resistencia osmtica (ORT)

Test de endsmosis celular (HOST).

Evala la integridad y funcionalidad de MP del spz
(del flagelo), asociada a capacidad de penetracin al
vulo.
Permite medir la habilidad de la MP para transportar
fluidos selectivamente (MUOZ y PAUCAR, 2005).

Pruebas funcionales

Integridad de la membrana plasmtica

Test de endsmosis celular (HOST).

Capacidad de enroscamiento de cola, indica: transporte
a travs de MP es normal, indicador de integridad y
funcionalidad de la MP (CAMACHO, 2000). Valores
normales 62% de spz hinchados, inferiories a 60% son
patolgicos (MUOZ y PAUCAR, 2000)

Pruebas funcionales

Integridad de la membrana plasmtica

Test de endsmosis celular (HOST).

Tras dilucin del semen en medio hipoosmtico, se
incuba x 30 a T ambiente, luego se fija la muestra y
se contabiliza el % de spz con endsmosis positiva.
A > % de stos, > calidad de la muestra.

Pruebas funcionales

Integridad de la membrana plasmtica

Test de endsmosis celular (HOST).

Pruebas funcionales

Integridad de la membrana plasmtica

Test de resistencia osmtica (ORT)

Permite analizar, con
reproductivo de machos.

alta

fiabilidad,

potencial

Se basa en integridad de la Mb del acrosoma sometida

a choque osmtico.
Se diluye 0,2 ml de semen en 3 ml de diluyente a 300
mOsm/Kg, incubado en bao a 39 C x 15 min (A), con
otra muestra realizamos la misma operacin pero con
diluyente a 180 mOsm/Kg, se incuba x 120 min (B).
Luego, se fija la muestra (glutaraldehido), se
comprueba estado de acrosomas, se contabiliza el %
de acrosomas en 100 spz contados, diferentes
campos.

Pruebas funcionales

Integridad de la membrana plasmtica

Test de resistencia osmtica (ORT)

O.R.T. = ( % A + % B ) / 2
El resultado de dicha frmula clasifica las dosis seminales en
cinco categoras en funcin de su calidad:
Muy buenos: ORT >70%
Regulares: ORT 54 y 63%
Muy pobres: ORT <46%

Buenos: ORT 64 y 70%

Pobres: ORT 46 y 53%

Pruebas funcionales

Test de resistencia trmica:

Basada en evolucin de la motilidad cuando
se somete a los espermatozoides a incubacin
(37- 39C).
In vivo, los espermatozoides tendrn que
resistir durante un tiempo en el tracto
reproductor femenino antes de fecundar.
Muestras que presenten escasa resistencia,
pueden tener problemas de fertilidad in vivo.
Se evala, por lo general, a los 30 y 150
post calentados.

Pruebas funcionales

Funcionamiento de las
mitocondrias

Mitocondrias son las encargadas de producir E

necesaria para las funciones del spz (motilidad).
Se usan tinciones fluorescentes (las mitocondrias
funcionales son capaces de producir un compuesto que
forma agregados de color distinto a las no funcionales).
Dentro de ellas,
Rodamina 123: verde en mitocondrias con alto
potencial de membrana interna (mitocondrias
funcionales).
JC-1: color verde en mitocondrias sin respiracin
oxidativa, naranja en mitocondrias funcionales

Pruebas funcionales

Procesos de capacitacin y reaccin

acrosmica

Capacitacin: conjunto de cambios que sufre el spz en el

tracto reproductor femenino, necesario para que sea capaz
de fecundar.
A mayor % de espermatozoides capacitados, menor
longevidad de los espermatozoides in vivo.
Se puede tambin estudiar el comportamiento de los spz
cuando se les somete a tratamientos capacitantes (si
responden bien o no).
Los espermatozoides de animales frtiles, presentan
mayor respuesta al ser tratados con sustancias
capacitantes.

Pruebas funcionales

Procesos de capacitacin y reaccin

acrosmica
Estudio de estadio de capacitacin: iones de Ca
Tincin con clortetraciclina (CTC)
Fluo-3: evaluacin de niveles de Ca intracelulares.
Estudio de estadio de capacitacin: organizacin
lipdica
Merocianina 540: detecta cambios en fluidez de mb.
FITC-Anexina V: detecta alteracin en la asimetra
de la mb (exposicin de fosfatidilserina-PS).
Ro-09-0198 marcado: detecta alteracin en la
asimetra de la membrana (exposicin de
fosfatidiletanolamina-PE).

Grado de apoptosis
espermtica.
Flourocromo
BP

Permeabilidad

AV + FITC
(FL1)

525

Indica inicio de apoptosis, identificando clulas con

exteriorizacin de PS, ligndose a esta.

IP (FL3)

620

Clulas con prdida de integridad MP (muertos), se liga al ADN.

AV binding buffer

Tubo 1

Medio con calcio, permite la unin del AV con la PS.

Tubo 3

Tubo 1:
Muestr
a

IP +
AV-

IP +
AV+

Tubo 3:
Muestr
a + IP
+ AV
Tubo 2

Tubo 2:
Muestr
a + IP

IP AV-

No viables (IP +) y
sin apoptosis (AV -)
Viables (IP -) y sin
apoptosis (AV -).

IP AV
+

No viables (IP +) y
con apoptosis (AV +).
Viables (IP -) y con
apoptosis (AV +).

Pruebas funcionales

Integridad y estructura de la cromatina

Importante por su contribucin en formacin del embrin.
Si no est bien, provoca fallos en desarrollo embrionario.
Compactacin anormal de cromatina, y su susceptibilidad a
desnaturalizacin, conducen a problemas en el desarrollo
embrionario.
Daos en DNA se pueden medir a distintos niveles. 3 tipos
de anlisis:
Anlisis que estudian la condensacin del ADN: COMET
o tinciones, SDS
Anlisis que estudian la presencia de simples y dobles
hebras de ADN: SCSA, TUNEL
Anlisis que estudian la fragmentacin nuclear: es ms
especfica de apoptosis.

Pruebas funcionales

Integridad y estructura de la cromatina

SCD: Sperm Chromatin Dispersion Test

Otros anlisis
Deteccin de peroxidacin lipdica:
Radicales de oxgeno libres daan distintas
estructuras de spz.
Deteccin de productos finales (reaccin del cido
tiobarbitrico)
Deteccin de peroxidacin de fosfolpidos y
colesterol en la membrana. Uso de tincin
fluorescente (C11BODIPY581/591). La tincin
cambia su fluorescencia tras la peroxidacin.
Marcadores de apoptosis: anexina-V, caspasas.
Marcadores bioqumicos: enzimas acrosmicos, etc.