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La CMF que se aplica en la rutina diaria de

muchos laboratorios clínicos y de investigación, capaz


de proporcionar resultados de forma rápida que
pueden ser aplicables al diagnostico.

Es un método que permite la determinación


simultanea de multiples características físicas de una
célula, mientras las células pasan a traves del
instrumento de medición fomando una sola fila a una
velocidad de 500 a 4000 células por segundo

El citometro de flujo permite estimar el tamaño de


la célula, las caracteristicas de su superficie y
citoplasma y su contenido de DNA.
El citómetro se compone de un sistema fluídico, óptico y electrónico que
recoge la información generada por la interacción celular con un haz de luz
enfocado, basándose en la capacidad de la célula para dispersar la luz incidente
y emitir fluorescencia, mediante una serie de lentes colocados en la zona de
detección se recoge la luz dispersada y es dirigida hacia detectores especiales
que producen una señal eléctrica proporcional a la luz que reciben, estas
señales son amplificadas y pasadas a la computadora para su conversión a una
forma digital, los datos de cada partícula o evento son recolectadas y sus
características o parámetros proporcionan información estadística sobre las
diversas subpoblaciones celulares presentes en una muestra.
Mediante la citometría de flujo se pueden detectar
cinco parámetros, dos que corresponden a la dispersión
de la luz y los restantes corresponden a las emisiones
fluorescentes , estos parámetros se pueden medir
simultáneamente sobre cada célula individual y luego
mediante un procedimiento se pueden separar u
obtener subpoblaciones celulares a partir de poblaciones
heterogéneas.
Esta compuesto por

SISTEMA FLUÍDRICO SISTEMA


SISTEMA OPTICO ELECTRICO
Inyecc
ión de Cámar constituido Amplific Convertid
la a de por lentes, espejos
ador Siste detectan r. y
y filtros, que ma convierten
muest flujo
en la que se enfocan el haz de infor las
para señales
ra orienta el flujo luz para iluminar la luminosas
almacenamien en impulsos
de células y se muestra y to ymatic
análisis eléctricos
consigue el o
de los datos
paso de éstas descomponen la y estos en
en tiempo señales
en forma emisión de real digitales
individual.  fluorescencia  
SISTEMA FLUÍDRICO
Este sistema consta
de dos fluidos

otro que lo
Uno que contiene
envuelve a fin
en suspensión
de darle
a la muestra estabilidad
(sheath fluid).
Un cristal con movimien
ondulado aproximadamente
90,000 veces/segundo, el cual
rompe el flujo en gotas en
individuales. La ubicación de la
última gota que se encuentran
en el fluido es muy controlable.

Las muestras se separaran en


X o Y estas se comparan con
un criterio de clasificación
actual.
Después de un tiempo de
retraso. Se introduce la varilla
cargada.

Las cargas se aplican en el


momento en que la célula llega
a la última gota

Las gotas se desvian al pasar


entre las placas con cargas

Partículas que no cumplan los


criterios pasar directamente a
los residuos
SISTEMA OPTICO

sistema se compone de dos tipos de ópt

óptica de Optica de lectura


excitación compuesta

compuesta de el *por las lentes de


recolección de luz.
láser y las lentes
para enfocar y *filtros para direccionar
longitudes de onda hacia
dirigir el haz de los detectores
correspondientes.
luz.
FUENTE DE LUZ

La totalidad de los modelos actuales llevan una


fuente emisora laser.

La longitud de onda utilizadas en citofluorometria


son 488, 568, 630 y 647 nm siendo la primera la
mas habitual.

Los laser ultravioleta cada vez se usan menos debido


a que han ido apareciendo fluorocromos excitables
con luz visible.

Los emisores laser mas empleados son los de helio-


neon (atomicos), argon-kripton (ionicos) y helio-
cadmio (moleculares). Recientemente se han
empezado a introducir los basados en
semiconductores (laser diodo).
SISTEMAOPTICO
FILTROS OPTICOS
Son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia
el detector

pueden ser: DE ABSORCION


DE INTERFERENCIA
Absorben las long de onda no
deseadas
De éstos hay tres tipos:

Filtros Filtros
Band Filtros
reflejan las long Long
Pass : Short
de onda no Pass:
deseadas Dejan Pass:
Dejan Dejan
pasar
un pasar por pasar por
rango debajo de encima
de una de una
SISTEMA ELECTRICO

Convierte todo en señales digitales para


almacenar en la computadora
 INFORMACION OBTENIDA
POR CITOMETRIA DE FLUJO

Básicamente podemos obtener los siguientes


datos:
Tamaño de la célula
Complejidad de la membrana celular
Con el uso de fluorocromos se puede
deterctar hasta 3 colores con un mismo
láser
Señales de
dispersión
La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula
que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en
todas las direcciones del espacio.
Las características morfológicas que determinan la dispersión de la
luz son fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo
y el material granular del interior de la célula, llamado
complejidad.

Laser
Detector

Detector de 90º
Señales de
Fluorescencia
Los Fluorcromos son productos quimicos que al ser estimulados con fotones
con longitud de onda comprendida entre determinados rangos (de
excitación) emiten a su vez otro foton de longitud de onda mayor (de
emision). El prototipo es la fluoresceina que al ser estimulada con luz
ultravioleta (no visible) emite luz de color verde (visible) aunque existen
muchos otros como picoeritrina, rodamina, rojo de texas etc.

La utilización de fluorocromos permite detectar y cuantificar un gran


número de parámetros celulares.

La fluorescencia emitida por estas moléculas, cuando son excitadas


por el haz de luz, genera información acerca de su presencia en
células o partículas individuales.
Laseres 350 457 488 514 610 632
comunes 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

PE-TR Conj.

Texas Red

PI

Etidio

PE

FITC

Acido Parinárico
La fluorescencia se emite en todas las direcciones, pero es monitorizada
por un detector óptico en posición ortogonal con respecto al haz de
iluminación. Pueden ser cuantificadas, separadamente, en emisiones de
varios fluorocromos diferentes en la misma célula, usando espejos , que
son separadores del haz luminoso, y filtros que seleccionan longitudes de
onda adecuadas. 
Fluorescencia
Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y
vuelve al estado basal emitiendo un fotón.

Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos


estados, por tanto, el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de
onda) que el que fue absorbido.

λ 2
λ
E

1
λ 1<λ 2

t (µ s)
Fluoresceina (FITC)
Excitación Emisión
300 nm 400 nm Wavelength
500 nm 600 nm 700 nm

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm


R e la tiv e In te n s ity

Proteinas
Morfología y antígenos de diferenciación en el
análisis de la heterogeneidad celular
Granulocitos Monocitos
CD15+ CD14+

Linfocitos
CD3+
Τ 2α β
Τ 1γ δ
CD4+
CD8+
CD56+
CD19+
CD5+
0
FSC-Height ->
256 512 768 1024
CD5-
4C5144001
CITOGRAMAS DE
FLUORESCENCIA

A: Células que coexpresan ambos Ag con alta intensidad (A).


B: Células que coexpresan ambos Ag con intensidad media (B1) o para uno de ellos
(B2-B3).
C: Células que expresan un solo Ag con alta intensidad. (C)
D: Células que expresan un solo Ag con intensidad media. (D).
E: Células que no expresan ninguno de los Ag. (E)
F: Expresión heterogénea.
Proceso de señales

Separación de señales luminosas

Detección de señales luminosas


Amplificación de señales eléctricas
Corrección de errores
– Compensación de señales
– Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos).
Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales
Almacenamiento de la información resultante
medida
Compensación FL-1 FL-2
excitación
de señales
Fundamento

Intensidad de fluorescencia
Superposición de
espectros de emisión.
Parte de la señal es
emitida por un
fluorocromo es leída
por el detector de otro
color
FL-2 - %FL1
Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de
pulsos)

• Señal analógica (V)


• Altura de señal (H)
• Anchura de señal (W) H
V
• Área de señal (A)
A
W
En base a la información de área y t
anchura se pueden detectar
dobletes (dos células que pasan
juntas).

2
xW
DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE
INFORMACIÓN

N FSCSSC FL-1 FL-2FL-3FL-4TIEMPO

1 2 1 1 1 1 2 1
2 2 1 1 2 3 2 1
3 3 2 3 3 3 3 1
4 4 2 4 1 4 3 1
5 3 1 1 2 1 5 2
6 4 2 1 3 1 5 2
7 2 3 2 1 3 1 2
8 2 8 1 2 4 2 2
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
10000
Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales
digitales
Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado
(almacenamiento multiparamétrico).
Representación monoparamétrica de
datos.
Histogramas. Se representa en cada valor de x
(intensidad de fluorescencia) y Y el número de
células que emiten esa intensidad.

M1
Representación biparamétrica en 2D
Diagrama de puntos “dot plot”

Representación
simultánea de dos
parámetros X e Y.
-+
X representa el valor FL-2 ++
de la señal de un
parámetro.

Y representa el valor
de la señal del otro. - - FL-1 +-
FL-1
Representación 3D
Contour plot / Diagramas de
contornos
X, Y más una tercera dimensión.

* Una superficie
tridimensional
*La altura representa el
número de células con una
determinada combinación
de ambos parámetros.
Gates
biparamétricos.
Se pueden utilizar puertas R1
biparamétricas definidas en
base a la combinación de los R3

valores de dos parámetros

Se emplean para estudiar las


características de
subpoblaciones celulares R2

R4
VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE
FLUJO
Medidas multiparamétricas (x, y, z)
en grandes números de células
individuales (miles).
Aumento en la representatividad de
las muestras estudiadas y en la
precisión de las medidas.
A menor tiempo de dedicación mayor
DETECCION Y CUANTIFICACIO CUANTIFICACIO
CUANTIFICACIÓ N DE ADN N DE ARN
N DE Ag.

Permite la Permite Proporciona


determinacion de determinar la la
anfígenos celulares existencia de información
de superficie, tiene anomalías clónales sobre el
utilidad en el en el DNA contenido del
inmunotipaje de (aneuploideas de RNA en los
leucemias agudas y DNA). reticulocitos
síndromes En el área de dato que
linfoprolerativos patología tumoral indica su
crónicos, para contribuye al estado
realizar esta diagnostico y a la madurativo.
identificación Ag se