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Mtodo de separacin en un

bioproceso por
CENTRIFUGACIN
UNIVERSIDAD TECNOLGICA DEL USUMACINTA
ING. EN PROCESOS BIOTECNOLGICOS
OPERACIONES UNITARIAS

Centrifugacin
La centrifugacin se puede llevar a cabo a escala
preparativa o escala analtica. La primera se utiliza
para aislar partculas para su aprovechamiento
posterior

propiedades

la

segunda

fsicas

como

permite
la

sedimentacin o el peso molecular.

determinar

velocidad

de

Centrifugacin
La centrifugacin preparativa se utiliza para separar partculas
segn

la

velocidad

de

sedimentacin

(centrifugacin

diferencial), la masa (centrifugacin zonal) o la densidad


(centrifugacin isopcnica). En el primer caso se obtiene un
lquido sobrenadante y un materioal sedimentado. En los otros
dos casos las patculas se distribuyen en fracciones de
diferentes densidades de un fluido lquido (centrifugacin
mediante un gradiente de densidades).

Centrifugacin
Las partculas se pueden separar en funcin de la
velocidad

de

sedimentacin

(centrifugacin

diferencial), la masa (centrifugacin zonal) o la


densidad

(centrifugacin

isopcnica).

La

centrifugacin zonal y la centrifugacin isopcnica


constituyen ejemplos de centrifugacin mediante
un gradiente de densidades.

Hay diferentes tipos de centrfugas segn el rango de velocidades de giro:


A. Centrfugas de baja velocidad, de sobremesa o clnicas. De pequeo tamao y
sin refrigeracin. Alcanzan una velocidad mxima de 5000 rpm. Son tiles para la
separacin de partculas grandes como clulas o precipitados de sales insolubles.
Las centrfugas micrfugas son una variante de las anteriores que permiten llegar a
velocidades de ms de 10.000 rpm, Los volmenes de trabajo son muy pequeos. Son
tiles en el campo de la biologa molecular.
B. Centrfugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades de entre 18.000 y 25.000
rpm. Son refrigeradas y algunas tienen sistema de vaco para evitar el calentamiento
del rotor a causa del rozamiento con el aire. Son tiles en la separacin de fracciones
celulares, pero insuficientes para la separacin de ribosomas, virus o macromolculas
en general.
C. Ultracentrfugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares
de refrigeracin i de alto vaco. Hay ultracentrfugas analticas que permiten la
obtencin de datos precisos de propiedades de sedimentacin (coeficientes de
sedimentacin, pesos moleculares), y preparativas, tiles para aislar partculas de bajo
coeficiente de sedimentacin (microsomas, virus, macromolculas).

Centrifugacin diferencial:

Se basa en la diferencia en la densidad de las molculas. Esta


diferencia debe ser grande para que sea observada al centrifugar.
Las partculas que posean densidades similares sedimentarn
juntas. Este mtodo es inespecfico, por lo que se usa como
centrifugacin preparativa para separar componentes en la mezcla
(por ejemplo, para separar mitocondrias de ncleos y membrana)
pero no es til para separar molculas.

Centrifugacin isopcnica:
Partculas con el mismo coeficiente de sedimentacin se separan al
usar medios de diferente densidad. Se usa para la separacin de
ADN con mucha frecuencia.

Centrifugacin zonal:

Las partculas se separan por la diferencia

en la velocidad de sedimentacin a causa


de la diferencia de masa de cada una. La
muestra se coloca encima de un gradiente
de densidad preformado. Por la fuerza
centrfuga

las

partculas

sedimentan

distinta velocidad a travs del gradiente de


densidad segn su masa. Se debe tener en
cuenta el tiempo de centrifugacin ya que
si se excede, todas las molculas podran
sedimentar en el fondo del tubo de ensayo.

Permite

Ultracentrifugacin:

estudiar

las

caractersticas

de

sedimentacin

de

estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y


biomolculas. Utiliza rotores (fijos o de columpio) y sistemas de
monitoreo.

Existen

diferentes

maneras

de

monitorear

la

sedimentacin de las partculas en la ultracentrifugacin, el ms


comn de ellos mediante luz ultravioleta o interferones.

Mtodo de extraccin de ADN


Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una
lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los
restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio
de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial
complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el
cido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los
siguientes:
rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.);
tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con
tioles, etc.);
digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).

Rotura de la membrana celular y extraccin del


ADN genmico.

Mtodos de purificacin
Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de
extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o ms
tcnicas de las siguientes:
extraccin/precipitacin;
cromatografa;
centrifugacin;
separacin por afinidad.

Etapas de la extraccin del ADN. La


homogeneizacin y lisis celular son
similares en ambos protocolos. Protocolo
tradicional: separacin de protenas y
lpidos con solventes orgnicos (1A);
precipitacin del ADN mediante etanol y
sales (1B) y Redisolucin del ADN (1C).
2. Protocolos comerciales (membrana de
slice y perlas magnticas): unin del
ADN a la matriz inorgnica (2A);
separacin de protenas y lpidos
mediante soluciones a pH bsico (2B);
recuperacin del ADN de la matriz (2C).
Las flechas circulares indican ciclos de
centrifugacin.