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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

ANTONIO
ABAD DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS TROPICALES
CC PP: INGENIERIA EN INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

BIOQUIMICA DE ALIMENTOS
CARACTERIZACION DEL COLORANTE AMARILLO 5
(TARTRAZINA ) EN EL NECTAR DE PIA

NOMBRE:FERNANDO BEJAR DURAND

CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIN O HPLC


La HPLC es un procedimiento analtico para la separacin, identificacin y cuantificacin de sustancias
mediante la cromatografa de lquidos. Los comienzos de la HPLC, High Pressure Liquid Chromatography
(cromatografa lquida de alta presin) se remontan a la dcada de los aos 60. Gracias a la mejora de los
materiales para las columnas y de los aparatos, se puede hablar desde finales de los 70 de High
Performance Liquid Chromatography (cromatografa lquida de alta eficacia)
Aplicaciones en Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC): Como aplicaciones de
la cromatografa de repartoen productos de alimentacin : edulcorantes artificiales, antioxidadntes,
aflatoxinas,aditivos,colorantes,aminocidos,proteinas,carbohidratos,lpidos.
Las aplicaciones de la cromatografa inicaest el anlisis de drogas y sus metabolitos, sueros,
conservantesdealimentos,mezclasparavitaminas,azcares,ypreparacionesfarmacuticas.
Respecto a las aplicaciones referidas a productos alimenticios encromatografa por exclusin de
tamaos:separacindecidosgrasos,determinacindeglucosafructosaysacarosaenzumosenlatados.
Cromatografa inica:
La cromatografa inica se usa para separar y determinar especies inicas. La fase mvil es un lquido
acuosoysalinoquecontieneundisolventeorgnicocomometanoloacetonitriloyuncompuestoinicoque
aportauncontraiondecargaopuestaalanalito.Laelucindelosparesinicosseconsiguemedianteuna
disolucinacuosademetanoluotrodisolventeorgnicosolubleenagua.Lafaseestacionariaesunaresina
de intercambio inico. Se trata de un material polimrico (Ej: poliestireno), que contiene muchos grupos
funcionalespormolculayprcticamenteinsolubleenagua.

COMPONENTES BSICOS EN UN EQUIPO DE HPLC:

SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MVIL:


Setratadeunreservorioovariosreservoriosparalosdisolventes.Sirveparadesgasificaryeliminar
partculas en suspensin de los disolventes que interfieren formando burbujas en los sistemas de
deteccin.
SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MVIL:
Seusanbombasparaimpulsaralafasemvilydebencumplirlossiguientesrequisitos:
Deben vencer altas presiones.
Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min.
Deben estar libres de pulsaciones y tener volmenes muertos pequeos.
Deben estar construidas de materiales resistentes a la presin y a las agresiones
qumicas.
Fcil manejo y mantenimiento.
Seutilizantrestiposdebombas:
Bombas recprocas
Bombas de desplazamiento
Bombas neumticas.

INYECTORES:
Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de
formareproducibleyadecuada.
Haydostiposdeinyectores
Septum: Inyecta la muestra mediante una jeringa. Se usa poco y no
permite mucha presin.
Bucle de muestreo: Este dispositivo normalmente se encuentra
integrado en el equipo cromatogrfico y existen bucles
intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra.
PRECOLUMNAS
Secolocandelantedelacolumnaparaeliminarlamateriaensuspensinylos
contaminantes de los disolventes. La composicin del relleno debe ser
semejante al de la columna. Aunque el tamao de partcula es mayor para
minimizarlacadadepresin.Enmuchasocasionesseusanparaaumentarla
vidadelacolumna.

COLUMNA:
Normalmentesondeaceroinoxidable, vidrio, slice fundida, o teflndedimetrointernouniformeaunqueen
ocasionesseencuentrantubosdevidriodeparedesresistentes.
Lamayoradelascolumnasdecromatografadelquidostienenunalongitudentre10y30cm.Generalmente
son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las
columnasesamenudode4a10mmylostamaosdelaspartculasdelosrellenosmscomunesson3,5y
10m.
Los empaquetados ms comunes son de partculas de slice pero tambin se usa la almina, polmeros
porososyresinasdeintercambioinico.
La columna ms utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno, empaquetada con
partculasde5m.Estascolumnastienende40.000a60.000platos/metro.
Desde hace poco, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas, las cuales tienen
menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que
oscilan entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m.Amenudo su longitud es de 3 a 7,5 cm.
Pueden tener hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de
disolvente caracterstica muy importante ya que los disolventes de alta pureza que se requieren en
cromatografadelquidossonmuycaros.

DETECTORES:
Adiferenciadelacromatografadegases,enHPLCnoexistendetectorestanuniversalmenteaplicables,ni
tanfiablestampoco.EnloquesicoincidencromatografadegasesyHPLC,sonlascualidadesenumeradas
enlosdetectoresdecromatografadegases.
EnHPLCexistendostiposbsicosdedetectores:
Los basados en una propiedad de la disolucin: Que corresponden a una propiedad de la
fase mvil, como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, la densidad...
Los basados en una propiedad del soluto: Es decir, responden a alguna de las
propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad de difusin, que no
son propias de la fase mvil.
Detectores ms comnmente usados en HPLC.
Pasoahacerunabrevedescripcindealgunosdeellos:
Detectores de Absorbancia: Miden la absorbancia de los efluyentes de una columna
cromatogrfica. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los
haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para
comparar las intensidades de los dos haces se usan detectores fotoelctricos contrastados. En
cualquier caso, el cromatograma consiste en una representacin en funcin del tiempo del
logaritmo del cociente de las dos seales transducidas. Tambin se utilizan instrumentos de un
solo haz, en cuyo caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria
de un ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia.
Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un detector
fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Los detectores ms
sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la

Detectores de ndice de refraccin: Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que
responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de
llama en cromatografa de gases. Se aade que son fiables,no dependen del caudal, son muy sensibles
a los cambios de temperatura,yse han de mantener a una temperatura constante. Por otra parte, no
son tan sensibles como la mayora de los otros detectores,ypor lo general no se pueden utilizar en la
elucin con gradiente.
Detector de dispersin de luz: El efluyente de la columna pasa a un nebulizador donde se convierte
en una fina niebla gracias a un flujo de nitrgeno o aire. Estas finas gotitas pasan por un tubo de
conduccin a una determinada temperatura de forma que se evapora la fase mvil y se originan
partculas de analito. Estas partculas pasan a travs de un lser y por un fotodiodo de silicio se detecta
la radiacin dispersada perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja es que resulta ser ms sensible
que el detector de ndice de refraccin.
Detectores Electroqumicos: Actualmente hay varios tipos de detectores electroqumicos, que se
basan en cuatro mtodos: amperometra, voltamperometra, coulombimetra, conductimetra.
Detectores por espectrometra de masas: Consiste en el acoplamiento de la cromatografa de
lquidos con la espectrometra de masas. De forma general se pueden obtener tanto cromatogramas a
tiempo real como reconstruidos por ordenador hasta los espectros de los picos eluidos.

MATERIALES Y MTODOS

El anlisis de las muestras se realiza con una columna llena con un copolmero reticulado de estireno y
divinilbenceno que se ha modificado con grupos de sulfato de sodio. Este material aprovecha el mecanismo de
exclusin de ionos. Esto significa que los analitos se separan en funcin de diferentes interacciones inicas.
Debidoalosgrupossulfonatosenlasuperficiedelmaterial,losporospresentanunacarganegativa.Estoprovoca
que las molculas con carga negativa no puedan penetrar en los poros del material y acelera su elucin. Esta
exclusinsebasaenelequilibriodeionesenmembranasdeGibbs-Donnan.Losanalitosquepuedanpenetraren
losporosseseparanenlasuperficiedelafaseestacionariamediantediferenciasestricasascomointeracciones
hidrfobasypolaresconlosgruposfuncionales.
Lostiemposderetencindelosdiferentesazcaressedeterminaronmedianteelregistrodelasealdelndicede
refraccin(RI).LasealRIseindicaenunacifraadimensionalennRIU(nanoRefractiveIndexUnit)yconstituye
ladiferenciaentreelndicederefraccindelamuestraenlacluladelamuestraylafasemvilenlaclulade
referencia.
Como fase mvil se utiliz agua ultrapura para efectuar la desgasificacin necesaria para la HPLC, el agua
ultrapura se filtr al vaco.

PROCEDIMIENTO
En la HPLC, el fluido debe ser especialmente puro, tanto fsica como qumicamente, no debe contener
sustancias o partculas en suspensin ni sustancias disueltas que puedan liberarse de la columna con retardo
y emitir con ello una seal. La calidad del disolvente es a menudo determinante por lo que respecta a la
fiabilidad de un anlisis HPLC. La presencia de trazas de impurezas en la elucin del gradiente puede
provocar la aparicin de picos fantasma. Estas trazas de sustancias se van acumulando en la columna lo
largo del anlisis y se liberan en el siguiente cambio de elucin. El agua empleada como fluido debe estar
libre de grmenes. Para ello pueden aadirse sustancias (p. ej. sales de cobre, acida de sodio) que previenen
la aparicin de grmenes o algas en el fluido. En este sentido es necesario tener en cuenta las
recomendaciones del fabricante de la columna, ya que el uso de aditivos incorrectos puede provocar daos
irreversibles en la columna.
EnlaHPLCsebombealamezclaasepararconayudadeundisolvente(mediodeelucin)odeunamezclade
disolventes(eluyente/fasemvil)ymedianteuninyectoryunabombaalcilindrodeseparacin,quesueleser
untubodeaceroinoxidablellenoconlallamadafaseestacionaria.Lafaseestacionariaconstanormalmentede
partculas porosas de gel de slice o de polmeros en cuya superficie estn fijados ligandos qumicos. Estos
ligandos son responsables de las interacciones selectivas de los analitos en la fase estacionaria, que son
necesarios para obtener una separacin cromatogrfica efectiva. Como mecanismos de separacin, y
dependiendodelamuestraylafaseestacionariasepuedentomarenconsideracinp.ej.laabsorcinporlas
fuerzas de Van der Waals, el intercambio de iones, la exclusin de iones y dems. En la separacin, las
sustanciasde muestra se retienen en el material de la columnadurante perodosde tiempodiferentes y,por
ello,abandonanlacolumnatranscurridostiemposdiferentes.Eldetectorregistraseguidamentecadaunodelos
componentes de la muestra y se evalan en un ordenador. El resultado es un cromatograma.El nmero de
picos equivale a la cantidad de componentes de la muestra separados, la superficie representa su cantidad
proporcional.

Separacindeazcaresinyectadosindividualmenteydeunamezcladeazcaresatravsdeuna
columna