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Deteccin de antgenos virales

RICARDO PEREZ ESPADA


NICKY LOZANO

Tcnicas inmunolgicas
Inmunofluorescencia directa

Es una tcnica mas antigua y de uso mas


difundido en el laboratorio clnico
La Muestras clnicas apropiadas son
recolectadas y colocadas sobre
portaobjetos donde se dejan secas y fijar

Luego se agregan AC especficos marcados con


isotiacianato de fluorescena (FITC ) que
difunde a travs de la membrana celular y se
combinan con los antgenos vricos en el interior
de las clulas
La reaccin AG AC se visualiza con el
microscopio de fluorescencia . por la aparicin
de fluorescencia de color verde

Test de aglutinacin
El test de aglutinacin es un mtodo simple de
un solo paso que a veces se usa para la deteccin
de antgenos virales en muestras clnicas

Los ensayos de aglutinacin


,dependen de la
fijacin inicial de anticuerpo antivirales especficos
sobre eritrocitos o partculas de ltex
Estas pruebas en general se complementan o se
confirman por medios de otros ensayos debidos al
elevado porcentaje de reacciones inespecficas .

El test de aglutinacin ha sido usado para


detectar antgenos de rabtorivus en heces y
adenovirus

Radioinmunoensayo (RIA)
Fue originalmente aplicado para identificar en
antgeno de superficie de la hepatitis B
Este ensayo tiene buena sensibilidad y
especificidad

ENZIMOINMUNOANALISIS
La EIA para la deteccin de antgeno se basa
habitualmente en la captura del antgeno por
anticuerpos especficos unidos a una fase solida
EL AG viral se detecta mediante la adicin de
otro AC especifico conjugado a una enzima

ELISA
Enzyme-Liked
Immunosorbent Assay

INTRODUCCIN:
El mtodo ELISA, se basa en el uso de Ags o Acs marcados
con una enzima, de forma que los conjugados resultantes
tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica.
Al estar uno de los componentes (Ag o Ac) marcado con una
enzima e insolubilizado sobre un soporte o pocillo
(inmunoadsorbente) la reaccin Ag-Ac quedar inmovilizada
y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de
un substrato especifico que al actuar, la enzima producir un
color observable a simple vista o cuantificable mediante el
uso de un espectrofotmetro o un colormetro.

TIPOS:
ELISA no competitivo:
Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que est en la fase
slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo Ag-Ac, y al
agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato
desarrollando color.
Directo: Detectan Ag
Indirecto: Detectan Ac
ELISA Sandwich
Doble (DAS)
Heterlogo (HADAS)

ELISA competitivo:
El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un nmero
limitado de sitios de unin del Ag. Habr ausencia de color en una
muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima
porque el conjugado ha sido desplazado por el Ac presente en la
muestra.

Pasos generales
1.
2.

Tapizado del pocillo con el Ag o Ac.


Adicin de la muestra problema
con la mezcla de Ags o Acs.
3. Unin del Ag o Ac especfico al Ag
o Ac tapizado en el pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de Ag o Ac no unido.
5. Adicin del Ac secundario marcado
con la enzima.
6. Unin del Ac secundario al Ag o
Ac.
7. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de enzima no unida.
8. Adicin del sustrato.
9. Unin del sustrato a la enzima.
10. Coloracin.

El primero es el
ELISA directo,
seguido del
indirecto

ELISA directo
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de Acs especficos.

2. Lavado con solucin salinaTween 20 como agente tensioactivo


(ph-7,2) para eliminar los Acs fijados deficientemente o no fijados.
3. Adicin de Ags marcados (conjugados) con una enzima; si los
Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedar solubilizado.

4.

Lavado para eliminar los Ags marcados que no hayan


reaccionado.

ELISA directo
5.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz


de actuar la enzima marcadora.

6. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.


Los lectores ELISA
se llaman
espectrofmetro
s!!

ELISA indirecto
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de Ags especficos.

2. Lavado con solucin salina Tween 20 como agente tensioactivo


(ph-7,2) para eliminar los Ags fijados deficientemente o no fijados.
3. Adicin de Acs marcados (conjugados) con una enzima; si los
Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedar solubilizado.

4. Lavado para eliminar los Acs marcados que no hayan reaccionado.

ELISA indirecto
5.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz


de actuar la enzima marcadora.

6. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA indirecto

Por si no les ha
quedado claro

LECTURA E INTERPRETACIN DE RESULTADOS:


Una de las grandes ventajas de la tcnica
ELISA es la posible automatizacin de la
lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha
automatizacin se puede conseguir con un
simple colormetro o espectrofotmetro de
cubeta o con sofisticados equipos de lectura
automtica de microplacas.
Los resultados finales de la lectura
colorimtrica se reflejan numricamente
mediante valores de absorbancia o
densidad ptica que se obtendrn a la
longitud de onda ms adecuada para la
coloracin final alcanzada.

APLICACIONES CLNICAS:
Enfermedades producidas por parsitos
Toxoplasmosis, Triquinosis, Tripanosomas

Enfermedades producidas por Micoplasmas


Enfermedades producidas por bacterias
Mycobacterium tuberculosis, brucelas, Estreptococos, Salmonelas

Enfermedades producidas por virus


Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vrica, Leucemia
felina

Otras aplicaciones
Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..)
Cuantificacin de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
Inmunopatologa (Ac anti-DNA, Factor reumatoide,
Inmunocomplejos circulantes)