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Proteínas ENZIMAS

CATALIZADORES
¿Que es un catalizador?
¿Que es un catalizador?
“Un catalizador es un compuesto que aumenta la velocidadde
una reacción química sin ser destruido o incorporado al
producto” (IUPAC)

• Ejemplo:
O O
H+
H3C C OH + C2H5OH H3C C OC2H5 + H2O
Reacciones unimoleculares
¿Cómo se define la velocidad de reacción?
¿De qué depende? Tres casos
¿Cuánto vale?
¿Cómo y cuando se calcula?
100

.02 .03
Molar
¿Qué unidades tiene? 80

% S remanente
60

S→P
40

20

d [ P]

.01
0

v=
0 10 20 30
Tiempo (min)

dt
0 0 10 20 30
− d[S ]
v= minutos
dt
pendiente de la
tangente a la curva =
- El Plegamiento proporciona un “andamio” que permite
a ciertos aminoácidos (catalíticos) estar en la posición
espacial adecuada para llevar acabo su función, además,
genera un medio ambiente adecuado para la captura de
los sustratos.
La posición espacial
relativa de los
elementos catalíticos
se mantiene aunque
la secuencia de
aminoácidos cambie.
TIM barrels
Cholinesterase Haloalkane dehalogenase
Dienelactone hidrolase Fluoroacetate dehalogenase
Lipase/Cutinase Epoxide hydrolase
Thioestearase Hydroxynitrile lyase
Serine Carboxypeptidase C-C Hydrolase
Prolyl Imino/Oligo peptidase 2,4-Dioxygenase
Bromoperoxidase Amilasa
- Flexibilidad: La “tapa” del sitio activo de algunas enzimas
presenta mobilidad.

- Sitios Alostéricos: Otros sitios pueden activar a la proteína


desde regiones alejadas del sitio activo.

- Cambios conformacionales: pueden suceder al unir un


sustrato.
Glucocinasa

Glucosamina 6-Fosfato-desaminasa
El tamaño de una enzima en relación con su función

- Aminoácidos catalíticos: Son los involucrados en la función.


- Están directamente involucrados en la catálisis.
- Ejercen un efecto en otro residuo o molécula de agua que
está directamente relacionado con la catálisis.
- Estabilizan el estado de transición.
- Ejercen algún efecto en el sustrato o cofactor que ayuda a
la catálisis.

- Aminoácidos del sitio activo no catalíticos: Participan en el


reconocimiento del sustrato y lo colocan en la orientación correcta.
Sitio Activo de la Tiamina Fosfato Sintasa

Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que


estabilizan al Pirofosfato.

Aminoácidos
catalíticos
Mg++ Arg59, Ser130,
Lys 159

Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que


estabilizan a los sustratos.
Lipases catalyse the hydrolysis of triglycerides:

O
H2C O R H2C OH
O O
lipase
HC O R HC OH + 3 HO R
O H2O
H2C O R H2C OH

The active site of lipases contain 3 essential amino acids:


asp, his and ser.

Lipases have ~250 other amino acid residues. Why?

Tripeptide asp-his-ser enhances the hydrolysis rate of


triglycerides by a factor 2-10; lipases by a factor 108-1012

How do they do that?


Why are lipases such active enzymes?

• Exact alignment of the asp, his and ser side


chains
• Stabilisation of the intermediate C-O
• Ensure the correct charges @ asp, his and ser
• Stabilise against proteolysis and denaturation
La triada catalítica SER-HIS-ASP

Serin-
proteasa de
Bacillus
lentus
Ejemplo de Catálisis, una Serina proteasa
Analysis of Catalytic Residues
in Enzyme Active Sites

JMB (2002) 324, 105-121


Conclusiones:

- Los aminoácidos mayoritariamente catalíticos son histidina,


cisteina, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina.
- Están muy poco expuestos al solvente, a pesar de su
polaridad.
- Casi todos están formando puentes de hidrógeno.
- Tienen una movilidad muy baja en comparación con los
demás aminoácidos.
- La función de un aminoácido catalítico es estabilizar un
intermediario del estado de transición, actuar como nucleófilo
o ser donador o aceptor de protones.
•Catálisis: Leyes Generales de la Catálisis
•Catalizadores biológicos
•Velocidades más elevadas de reacción
•Condiciones de reacción mas suaves
•Mayor especifidad de reacción
•Capacidad para la regulación
Sin
enzima

Energía de activación
(sin enzima)
Nivel de energía

Energía de activación
Con (con enzima)
enzima

Reactivos Productos
(S) C12H22O13 + H2O

(G) C6H12O6 + (F) C6H12O6


Reaction equations and reaction rate
1
A reaction like A → B Ea(1)

may run via route 1; 2

the rate is determined by the E


3
magnitude of Ea(1) A
B

Alternatively, the reaction runs via an intermediate, like 2.


The rate is determined by the slowest step (= the one with the
highest Ea).

Alternatively, the reaction can run via more intermediates, like


3
Features of a catalyst:

Makes an alternative reaction path in which less activation


energy is needed.

Equally increases the rate of the back and forth reaction


reaction ⇒ catalysis has no effect on equilibrium position!

v = k1 S – k-1P
k1 v = 0 = k1 Seq – k-1Peq
S k--1
P k1/k-1 = Peq/Seq = Keq
Keq = k1/k-1

k1 = 10 min-1 k1 = 10-3 min-1


Enzimática No Enzimática
k-1 = 10-1 min-1 k-1 = 10-5 min-1
¿POR QUE SUCEDE UNA REACCIÓN?

Teoría de las colisiones.


• En gas y líquidos, frecuencias muy altas:

A(g) + B(g) @ 1 Atm y 25 C


1028 colisiones /seg cm3
A
A+B menor frecuencia
A+B+C de colisiones

• Explica la proporcionalidad entre velocidad y concentración


Arrhenius (1889) Sólo las que alcanzan cierto nivel de energía.
Las activadas o exitadas; sólo las que adquieren…..

T E cinética velocidad choques


de las moléculas

v α S
v = k S
v = k Sn
Donde k es la constante de velocidad de reacción y n es el orden de la
reacción.
Orden y molecularidad: ¿es lo mismo? ¿Unidades de la constante de
velocidad?
Example: hydrolysis of alkyl bromides
R-Br + OH– → R-OH + Br– (SN2 reaction)

Reaction takes place by collision of the particles RBr and


OH–, implying that the reaction rate is directly proportional
to [RBr] and [OH–]. v = k (R-Br)(OH-)

Alternative:
slow OH-
R-Br R+ + Br- ROH + Br- (SN1 reaction)

These are the most common reaction situations:


- bimolecular: 2 particles collide and react
- monomolecular: 1 particle dissociates or reacts
v = k1(R-Br)
k2 + R-Br
Τ 1 Τ 2

Moléculas

Energía de activación
Energía Cinética
k = A e -∆ G++/RT ln k = ln A – ∆ G++
RT

Las energía de activación (∆ G++ )


de las reacciones enzimáticas son del orden
de 6000 a 15,000 cal/mol

Las energía de desactivación o desnaturalización (∆ G++ )


de activación una enzima son del orden
de 50,000 a 150,000 cal/mol (a bajas temperaturas
son estables pero al aumentar la T rápidamente se
desactivan.
k
¿En cuanto aumenta la velocidad de reacción del proceso de
Descomposición del peróxido de hidrógeno,

H2O2 H2O + O2

si la energía de activación de la reacción natural es


de 76 KJ/mol, mientras que la reacción con catalasa es de
30 KJ/mol?

Si una reacción tiene una energía de activación de 6,000 cal/mol


y otra de 60,000 cal/mol ¿Cómo influye en cada una de ellas el
aumento de la temperatura? (cada 10oC)
Temperatura (oC) Velocidad relativa Velocidad relativa
6,000 cal/mol 60,000 cal/mol

−10 1 1
0 1.55 79.4
20 3.24 126,000
40 6.31 1 x 108
60 11.4 3.6 x 1010
El caso de la orotidina-5´-monofosfato decarboxilasa
Determination of reaction rates
Determination of the concentration of a compound (substrate,
product), as a function of time.
The method used depends on the properties of the compound.

• Chromatography
– Example:

O Candida rugosa
O lipase O
+ H2C CH3
iPr2O +
OH H O CH3 OH

menthol vinyl acetate (1R,2S,5R)- (1S,2R,5S)-


(racemic) menthyl acetate menthol
GC analysis of the esterification of racemic menthol with vinyl acetate, catalysed by
Candida rugosa lipase, in diisopropyl ether as the solvent. I.S., internal standard
(decane). An enantioselective GC column is used, so the enantiomers are separated.
There is only one product peak because the reaction is stereoselective.
Another example: the chlorination of barbituric acid (1) by
chloroperoxidase from Caldariomyces fumago
O
H
HN barbituric acid
H
(1)
O N O
H

chloroperoxidase
H2O2, Cl-, pH 2.7

O
Cl
monochloro-
HN H barbituric acid
O N O (2)
H

chloroperoxidase
H2O2, Cl-, pH 2.7

O
Cl dichloro-
HN Cl barbituric acid
(3)
O N O
H t (min) →
• UV spectroscopy
•Example: chlorination of 1 by chloroperoxidase

Can be done quantitatively through Lambert-Beer’s law: A = ε .c.d


• IR spectroscopy
•Example: oxime formation
OH
O N
O- + H N OH O-
H3C 2 H3C
O O
IR (in D2O) ν max =1400 cm-1
ν max =1710 cm-1

Problem: not quantitative

• Polarimetry (only for chiral compounds)


•Example: hydrolysis of sucrose:
C12 H22 O11 + H2O → C6H12 O6 + C6H12 O6
sucrose + water → glucose + fructose
[α ]D20 = +66,5° [α ]D20 = +52° [α ]D20 = –92° (together [α ]D20 = –
40°)
Can be done quantitatively
• Titration
• Example: ester hydrolysis
Ester + water → acid + alcohol

Excellent for quantitative


measurements; hooked
up to computer.
ml base added vs time;
slope = reaction rate
¿Que tipo de reacciones catalizan?

Ε C 1._._._
Ε C 2._._._
Ε C 3._._._
Ε C 4._._._

Ε C 5._._._
Ε C 6._._._
1ª Ley de la Termodinámica:
La energía total de un sistema y sus alrededores es constante
∆ E = Ef – Ei = Q (calor absorbido - W (trabajo realizado)
por el sistema)
∆ E = ∆ H - P ∆ V En sistemas biológicos ∆ V=0 ∆ E=∆ H

La entalpía es una medida del contenido de calor de una sustancia. Cada sustancia pura posee entalpía,
o sea, una cierta cantidad de energía asociada en un estado particular de P y T

Es la energía que puede ser transferida en forma de calor cuando el proceso se realiza a presión
constante.

Lo que puede determinarse es el cambio en el contenido de calor de las substancias: ∆ H = H (final) – H


(inicial) Los signos matemáticos aplicados a los cambios en entalpía se interpretan como sigue:

∆ H positivo; se añade calor al sistema (proceso endotérmico)


∆ H negativo; el sistema libera calor (proceso exotérmico)

Por lo general, los valores de ∆ H se reportan a 25oC y 1 atmósfera de presión. Esto es lo que se conoce
como un estado a condiciones estándar y se representa por el símbolo ∆ Ho.

El calor de reacción es el cambio en entalpía asociado a esa reacción y equivale a:


∆ Ho reacción = Σ H productos – Σ Η reactivos

NO SON CRITRIOS DE ESPONTANEIDAD


ES UN PRINCIPIO DE CONSERVACIÓN.
Es energía potencial que se libera al transformar sustratos en productos.
Reacciones endotérmicas

X*

∆ Hd<0

∆Η a >0 Producto
Activaciónendotérmica
∆ Hr > 0
Sustrato
Reacciones exotérmicas ∆ Hr < 0 exotérmico
∆ Ha > 0 activación endotérmica
∆ Hd < 0 exotérmico
∆ Hr = ∆ Ha - ∆ Hd
X*

∆ Hd<0
Sustrato
∆ Ha>0

Activaciónendotérmica
∆ Hr < 0

Producto
∆ Hr > 0 endotérmico
∆ Hr < 0 exotérmico
Pero no es un criterio de espontaneidad de la reacción: La ley que prescribe la
dirección del flujo de energía es la segunda ley de termodinámica.
El Concepto de Entropía
• Una definición amplia de entropía es que ésta es una medida del grado de
desorden de un sistema. Esto se puede interpretar también en términos de
probabilidad: un estado de desorden es más probable que un estado
ordenado.
• El caso de la caja de canicas blancas y la de canicas negras. El calor no
fluye entre dos objetos a menos que estén a diferentes temperaturas.

∆ S univ = ∆ S sistema + ∆ S alrededores

Si ∆ S univ > 0 El sistema procede de manera espontánea del estado “a” al


estado “b”. La entropía del universo tiende a aumentar

Si ∆ S univ = 0 El sistema está en equilibrio y no se moverá de ahí


espontáneamente.

Si ∆ S univ < 0 El sistema procede espontáneamente pero en la dirección


inversa, es decir de “b” a “a”

Una reacción ocurre por la tendencia a buscar un estado de mínima


energía y por la tendencia a buscar aumentar el desorden.
El Concepto de Energía Libre
El ∆ Hr es el cambio de energía que acompaña a una reacción –
medida por calorimetría-.
¿Cuál es la máxima cantidad de energía que podemos extraer de la
reacción? La Energía disponible: ∆ G reacción
Si ∆ G > ∆ H o ∆ G < ∆ H ¿se cumple la primera ley?

1878 Gibbs: Una nueva función que resulta de la 1a y la 2a leyes:


∆ G= ∆ Η – Τ ∆ S
El cambio de energía = cambio de energía – cambio de energía
Libre (a P y T ctes) total de organización

eg. AgNO3 + HCl AgCl (s) + HNO3


(los sólidos tienen una estructura más ordenada)

∆ Η = −15.7 Kcal/mol
∆ G= −13.2 Kcal/mol
∆ Η - ∆ G = -2.5 Kcal/mol
Esta es energía que no puede usarse para generar trabajo, pues no esta
disponible; es usada para aumentar el orden: T∆ S (el cambio de entropía
en el proceso es negativo)
Si ∆ S > 0 mayor desorden ∆ G < ∆ H (aporte entrópico a la energía disponible)
Si ∆ S < 0 mayor orden ∆ G > ∆ H (consumo de energía para ordenamiento)

Es la combinación de ∆ G y ∆ H lo que determina la espontaneidad

Criterio de espontaneidad:

∆ G < 0 proceso espontáneo


∆ G = 0 proceso en equilibrio
∆ G < 0 proceso no espontáneo
Para una reacción A + B C+D
en cualquier momento:
∆ G = ∆ Go + RT ln [C][D]/[A][B]
donde: ∆ Go es la energía libre estandar (pH 7, 1atm, 25oC) y función de la naturaleza
de los reactivos.
En el equilibrio: ∆ G = 0 de donde: ∆ Go = - RT ln [C]eq[D]eq/[A]eq[B]eq
∆ Go = - RT ln Keq
∆ Go
Kcal/mol KJ/mol Keq
6.82 28.53 10−5
4.09 17.11 10−3
1.36 5.69 10−1
0.0 0.0 1
-1.36 -5.69 10
-4.09 -17.11 103
-6.82 -28.53 105
Catálisis ácido-básica

• La catálisis ácida general consiste en la Tautomerización ceto-enol


transferencia de un protón desde un
residuo de la enzima, que se comporta
como un ácido de Bronsted, al sustrato o
intermediarios de la reacción,
disminuyéndose así la energía libre del
estado de transición

• La catálisis básica general consiste en la


transferencia de un protón desde el
sustrato o intermediarios de la reacción
a un residuo de la enzima, que se
comporta como una base de Bronsted,
disminuyéndose así la energía libre del
estado de transición

• Si se dan ambos tipos de catálisis se tiene


una catálisis ácido-básica concertada

Muchas reacciones de importancia


bioquimica son suceptibles a catálisis
ácido/ base: hidrólisis de peptidos y de
ésteres, del grupo fosfato,
tautomerizaciones, adiciones de
a) Sin catalizar
grupos carbonilo…. b) B)Catális ácida general
c) Catális básica general
Catálisis electrostática

• Ocurre cuando la enzima estabiliza intermediarios o estados de transición de la reacción por


neutralización de cargas gracias a la disposición espacial en el sitio activo de residuos con carga
opuesta

• En otros casos la distribución de cargas en el sitio activo sirve para guiar a sustratos cargados o
polares a sus sitios de unión

• Es llevada a cabo por metaloenzimas que contienen iones metálicos fuertemente unidos ( metales
de transición como Fe2+ , Fe3+ , Cu2+ , Zn2+ , Mn2+ o Co3+ ) o por enzimas activadas por metal que
fijan débilmente a los inoes metálicos en solución (iónes metálicos alcalinos como Na+, K+, Mg2+
o Ca2+ )

• La funcion de los iones metálicos en la catálisis enzimática es


– Mediar reacciones de óxido-reducción
– Unir y orientar de los sustratos
– Estabilizar cargas negativas
– Promover la catálisis nucleofílica mediante la ionización del agua
Sitio activo de la anhidrasa
carbónica humana. La flecha
apunta hacia la cavidad del
sitio activo

Las moléculas ligadas


de agua, tienen un carácter
mas ácido.
Catálisis covalente

• En este caso se incrementa la velocidad de la reacción por la formación transitoria de un


enlace covalente entre un residuo de aminoácido de la enzima y el sustrato.

• La catálisis covalente consiste en tres estadíos sucesivos:


– Ataque nucleofílico de la enzima sobre el sustrato (formación del enlace covalente)
– Toma de electrones por el catalizador u otro sustrato (formación del producto)
– Separación del producto de la enzima (ruptura del enlace covalente, generalmente por
hidrólisis)
Mecanismo de reacción de la amiloglucosidasa
El más importante:
Catálisis a través de la fijación de un estado de transición a
la enzima, con mayor afinidad a la enzima que el sustrato o
el producto.

En conjunción con los mecanismos antes descritos.


La enzima distorsiona al sustrato hasta llevarlo a la geometría
del estado de transición, en la que no encajaría el sustrato sin
distorcionar.
Resumen sobre las estrategias de las
enzimas como catalizadores

Reducen la energía de activación de la


reacción.
i. Optimizan la posición de los residuos
catalíticos respecto al sustrato.
ii. Promueven la proximidad entre reactantes.
iii. Desestabilizan los estados basales.
iv. Estabilizan el estado de transición.
What kinds of catalysts are there around?
• Organic
• Inorganic
• Biological (biocatalyst)

Other way of subdivision:


• Homogeneous = freely dissolved in solution
– organic catalyst
– organometallic complex
– enzyme in water
• Heterogeneous = solid, in liquid or gaseous environment
– inorganic catalyst (e.g. zeolite)
– immobilised enzyme
– enzyme in an organic solvent