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ANLISI

S
MICROB
IOLGIC
O DE
MARISC
OS

Preparacin de la muestra
Mariscos con valvas
Materiales:

Recipiente de boca ancha con capacidad para 20 unidades de mariscos


con valvas.
Recipiente con escurridero de agua.
Vaso de precipitado con 500 ml de capacidad.
Vaso de licuadora estril.
Escobilla dura.
Cuchillo estril.
Cuchara estril.
Servilletas de papel.
Balanza de capacidad no inferior a 2.500 gramos y una sensibilidad de
0.1 gramo.
Licuadora de 2 velocidades.
Alcohol etlico de 70%.
Solucin buffer de fosfato o agua de peptona al 0.1%

Procedimient
o
1. Colocar

20 unidades de mariscos valvados en un recipiente de


boca ancha. Cepillar cada uno de ellos bajo el chorro de agua
potable, con especial atencin a las grietas y uniones de valvas.

2. Colocar

las muestras limpias en un recipiente con colador y


dejar escurrir el agua.

3. Lavar

y desinfectar las manos con alcohol de 70%

4. Colocar

la muestra en la mano sobre una servilleta de papel


limpia, de tal forma que una de las partes convexas, descanse
sobre la palma de la mano.

5. Insertar

el cuchillo en el punto de unin de las valvas. Cortar el


msculo aductor de la valva superior, palanquear las valvas y
dejar que el lquido caiga sobre el vaso de precipitado
previamente tarado. Retirar la valva superior y transferir la
carne al vaso conteniendo el lquido valvar.

6.
7.
8.

Pesar el vaso con la muestra extrada.


Transferir la muestra al vaso de la licuadora.
Adicionar una cantidad igual al peso de la muestra, de
solucin buffer de fosfato o agua peptonada al
0.1%

9. Homogenizar tomando las precauciones indicadas en


preparacin y dilucin de las muestras de alimentos (2
ml de este homogenizado contiene 1 gramo de
marisco).
En caso de que el homogenizado resulte de consistencia
pesada y difcil de pipetear, adicionar 3 partes de
diluyente en peso de la muestra (4 ml de esta muestra
contiene 1 gramo de la muestra en examen). Corregir
las proporciones a ser tomadas para la siembra.

Anlisis de la
muestra

Preparar las diluciones decimales, siguiendo una


de las tcnicas descritas en Preparacin y
Dilucin de las Muestras de Alimentos, hasta la
dilucin 10-4 10-5 si es necesario.

Efectuar las determinaciones microbiolgicas de


acuerdo al esquema de trabajo y a la
metodologa descrita.

Reportar los resultados por gramo de muestra.

Preparacin de diluciones
ndices Microbiolgicos:
1.
2.
3.
4.
5.

Numeracin de microorganismos
aerobios viables.
Numeracin de Coliformes fecales
(para muestras frescas).
Numeracin de Enterococos (para
muestras congeladas).
Investigacin de Salmonella.
Investigacin de Vibrio
parahaemolyticus.

NUMERACIN DE MICROORGANISMOS
AEROBIOS VIABLES

NUM
ERA
CIN
DE C
(PAR
A MU OLIFO
RME
ESTR
S FE
AS S
CAL
ECA
ES
S)

NUM
N
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DA
AS
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S
T IG A
CIN
DE S
ALMO
NELL
A

Investigacin de Vibrio
parahaemolyticus

ANLISIS
MICROBIOLGICO
DE PRODUCTOS
DESHIDRATADOS

TOMA DE
MUESTRA

PRODUCTOS A GRANEL
LA TOMA DE muestra en los compartimentos de los
barcos o en los vagones de tren se efectan durante la
carga o descarga.
Si no se pudiera efectuar este procedimiento utilizar
paletas estriles.
Recoger la muestra mediante la insercin de la paleta en el
producto.

ALIMENTOS ENVASADOS EN
SACOS O BARRILES

Eliminar la contaminacin superficial con alcohol de


70.
Abrir los paquetes cerrados con un instrumento
cortante.
Utilizar una paleta , los sacos se eligen de forma
aleatoria y tomar muestra de cada envase.
esto mismo se procede tambin en los alimentos
envasados a granel en caja de cartn.

FRUTAS SECAS ENVASADAS


EN CAJAS BOLSAS

UTILIZAR UN SACABOCADO del tipo utilizado


para tomar la muestra a partir del queso.
En caso de productos envasados en paquetes dentro
de una caja, elegir como muestra, un paquete tomado
en forma aleatoria.

PREPARACIN DE LAS
UNIDADES DE MUESTRA
PARA EL ANLISIS

HIGOS Y DTILES
1.
2.
3.
4.

SELECCIONAR 10 FRUTAS Y CORTARLAS en


dos con un cuchillo estril.
Pesar en una jarra estril.
Dejar en reposo 30 a temperatura ambiente.
Agitar a mano por 1-3 minutos.

PASAS,GROSELLAS,
CEREZAS,ETC

PESAR aproximadamente 100 piezas de fruta


en una jarra estril.
2. Dejar en reposo 30 minutos.
3. Agitar 1-3 minutos.
1.

VEGETALES
DESHIDRATADOS
a) VERDURAS
CON
b)

1.

2.

3.

4.

MUCHAS HOJAS :
PESAR 10-20g EN UN
ERLENMEYER ESTERIL
DE 250ml.
AGREGAR 190ml DE
AGUA
PEPTONADA
ESTERIL.
DEJAR
REHIDRATAR
POR 30 A T DE
REFRIGERACION.
AGITAR POR 30.

1.
2.
3.

4.

RAICES Y VEGETAL
SOLIDOS :
PESAR 10-20g EN UN
FRASCO ESTERIL.
AADIR 190ml DE
AGUA PEPTONADA.
DEJAR REHIDRATAR
POR 30 A T DE
REFRIGERACION.
AGITAR
POR
3
MINUTOS.

ANLISIS
MICROBIOLGICO
DE SOPA
DESHIDRATADA

INDICES
MICROBIOLOGICOS

(RECUENTO
ESTNDAR EN
PLACA O POUR PLATE O
RECUENTO EN PLACA POR
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD).
NUMERACION DE
MICROOORGANISMOS
AEROBIOS
MESOFILOS VIABLES

EL METODO SE RECOMIENDA
PARA PRODUCTOS LACTEOS
Y
PARA
ALIMENTOS
CONGELADOS
,ENFRIADOS
PRECOCIDOS O PREPARADOS
EXCEPTO QUE EL ULTIMO
ESPECIFICA
LA
TEMPERATURA
DE
INCUBACION DE 35.

I. EQUIPOS Y MATERIALES :
1. Los requisitos necesarios para la preparacin y
dilucin de las muestras de alimentos.
2. Placas de petri (100x15mm).
3. Pipetas bacteriolgicas de 1,5 y 10 ml .
4. Bao de agua regulado a 44-46C para mantener
el agar licuado.
5. Incubadora regulada a 29-31C.
6. Contador de colonias.
7. Agar Plate Count.

II. PROCEDIMIENTO:
1. Preparar la muestra por uno de los
procedimientos recomendados en la seccionpreparacion y dilucin de la muestra.
2. Pipetear por duplicado a placas de petri
estriles alcuotas de 1ml a partir de la
dilucin 10-1 , 10-2 , 10-3 , 10-4 y 10-5 y una
alcuota de 0.1ml de la dilucin 10-5 para
obtener de 10-1 a 10-6 g o ml de muestra por
placa de petri.
3. Agregar a las placas de petri 15 ml de
agar licuado y temperado .
4. Mezclar las alcuotas con el agar mediante
movimientos de vaivn y rotacin de las
placas petri .
5. Adicionar a placas de petri , agar sin
inocular y agar inoculado con el diluyente.

6. Invertir las placas e incubarlas a 29-31C


durante 483 horas.
7. Computo del Recuento Estndar en placa.
8. Computo del Estimado del Recuento Estndar en
placa.
9. Expresin de resultados.

NUMERACION DE
COLIFORMES FECALES
(DETERMINACION DEL
NMERO MAS
PROBABLE)

I. EQUIPOS Y MATERIALES:

1. Los requisitos necesarios para la preparacin


y dilucin de muestras de alimentos.
2. Incubadora a 35-37 .
3. Pipetas bacteriolgicas de 1ml.
4. Caldolauril sulfato (LST) volmenes de
10ml en tubos de 150x15mm

II. PROCEDIMIENTO:

1. Preparar la muestra de alimento por uno de los


tres mtodos descritos en el capitulo de
preparacin y dilucin de las muestras de
alimentos.
2.Pipetear 1ml de cada una de las diluciones del
homogeneizado de alimento en tubos de caldo
lauril-sulfato , utilizando tres tubos de dilucin.
3. Incubar los tubos a 35-37C por 24-48 horas .
4.Anotar los tubos que muestren produccin de gas
(PRUEBA PRESUNTIVA).

NUMERACIN DE
ENTEROBACTERIACEAS
(PRUEBA DE PRESENCIA
O AUSENCIA)

I. EQUIPOS Y MATERIALES :
1. Frascos de 100ml.
2. Pipetas bacteriolgicas de 1ml y 10ml
graduadas 0.1ml.
3. Incubadora a 35-37C.
4.Caldo peptona de caseina-peptona de harina de
soja (caldo casoy).
5. Caldo de enriquecimiento para
Enterobacteriaceas segn MOSSEL.

II.PROCEDIMIENTO
1. Preparar la muestra de alimento por uno de
los tres mtodos descritos en el capitulo de
preparacin y dilucin de las muestras de
alimentos.
2. Pipetear 1ml o pesar 1g del alimento y 1ml de la
serie de diluciones a frascos de 100ml
conteniendo 10ml de caldo casoy.
3. Incubar a 20-25C por 2 horas, agitando los
frascos cada 15min durante 30seg.
4. Adicionar 10ml de caldo de enriquecimiento de
enterobacteriaceas de doble concentracin .
5. Incubar a 35-37C por 20-24 horas.

NUMERACIN DE
CLOSTRIDIUM
PERFRINGENS

I. EQUIPOS Y MATERIALES:
1. Los requisitos
necesarios para la
preparacin y dilucin de muestras de
alimentos.
2. Placas de petri (100x15nm).
3. Pipetas de 1ml graduada al 0.1.
4. Bao de agua regulado a 44-46C.
5. Incubadora regulada a 35-37C.
6.Agar TSN (agar selectivo para clostridium
perfringens seg. MARSHALL) o
Agar TSC (agar triptosa sulfito ciclocerina).

II.PROCEDIMIENTO:
1.Preparar la muestra y las diluciones por uno
de los mtodos descritos recomendados en la
seccion sobre preparacin y dilucin de la
muestra . Preparar hasta la dilucin 10-3 .
2. Pipetear 1ml de cada una de las diluciones
por duplicado a placas estriles que contienen
una placa delgada de TNS o TSC (5ml).
3.Verter el agar fundido y templado a 45C y
mezclar , dejar solidificar.
4.Cubrir con una capa , de 5ml del agar
empleado, dejar solidificar.

5. Colocar las placas en posicin normal en una


jarra de anaerobiosis.
6.Incubar a 37C por 20 a 24 horas.
7. Contar las colonias negras y seleccionar las
placas que tengan entre 20-200 colonias en el
medio TSN y tambin TSC(recuento
presuntivo de clostridium perfringens).

DETECCION DE
SALMONELLA

I. EQUIPOS Y MATERIALES:
1. Frasco Erlenmeyer.
2. 225ml de Caldo Peptonado
Bufferado Caldo Lactosado.
3. Tubos de Ensayo.
4. Incubadora regulada a 35-37C.

I. PROCEDIMIENTO:
1. Pesar 25g de muestra.
2. Sembrar en 225ml de caldo de
enriquecimento Caldo Bufferado
Peptonado o alternativamente en
225ml de Caldo Lactosado.
3. Incubar 35-37C por 18-24 horas.

ANALISIS
MICROBIOLOGICO
DEL AGUA

TOMA DE LA MUESTRA
Muestreo en grifos o llaves.El grifo no deber tener alrededores o presentar escapes
de agua.
Antes de la recoleccin de la muestra se debe abrir el
grifo y dejar correr el agua durante 2 o 3 minutos para
eliminar impurezas y agua acumulada en el interior de la
caera.
Muestreo en ros, arroyos, lagos, etc.
Sumergir rpidamente el frasco debajo de la superficie
del agua (15 a 20 cm) para evitar recolectar material
flotante y dirigir la boca del mismo en sentido contrario

Identificacin de la muestra.En la etiqueta que se adosa al frasco se debe


anotar claramente:
El lugar del muestreo.
La fecha y hora exacta del mismo.
En el caso de muestra de agua potable, se
debe anotar tambin el cloro residual (total y
libre) encontrado a la hora del muestreo.
Observacin especial que sugiera
contaminacin (da idea de las diluciones a

Envase para la recoleccin de muestras.Se debe utilizar frascos de vidrio neutro o plstico, no
toxico, esterilizables, de boca ancha, con tapa protectora
y cierre hermtico, para evitar escapes de agua. Las
botellas de vidrio deben ser de borosilicato u otro vidrio
neutro, de preferencia provistas de tapa de rosca hecha
de metal o plstico. Las tapas de metal deben ser
forradas con un protector no toxico que evite el contacto
directo entre el metal y la muestra.
Las botellas de plstico ofrecen la ventaja de ser livianas
y resistentes. Se recomiendan que estas sean de
polipropileno o policarbonato.
El polietileno no es aconsejable porque no resiste bien la

Volumen de muestra.La capacidad de las botellas debe ser, por lo


menos, de 120 ml con el objeto de tomar una
muestra de 100 ml y dejar un espacio vaco que
facilite la agitacin del agua antes del examen.
Las botellas que se emplean para el muestreo de
100 ml de agua potable deben contener, antes
que su esterilizacin, 0.1 ml de una solucin al 10
% de tiosulfato de sodio (para que reaccione con
los vestigios de cloro libre).
Cuando se tenga que investigar P.aeruginosa y/o

Transporte y preservacin de la muestra.


Para muestras de agua potable al tiempo de
transporte al laboratorio no debe ser mayor de
48 horas y de preferencia, no ms de 30 horas.
Se recomienda refrigeracin (4-10 C) de las
muestras especialmente si se requiere un
recuento total en placa o si se sospecha que el
agua est contaminada con organismos
patgenos.
En muestras de agua superficiales, incluyendo

NALISIS DE LA MUESTR

EQUIPOS Y MATERIALES
Los requisitos necesarios para la preparacin y
dilucin de la muestra. Utilizar solucin de
fosfato para la preparacin de las diluciones.
Los requisitos necesarios para la numeracin
de microorganismos aerobios mesofilos
viables.
Los requisitos necesarios para la numeracin
de coliformes y coliformes fecales.(NMP,
mtodo 1)
Los requisitos necesarios para la numeracin

PROCEDIMIENTOS
Agitar vigorosamente el recipiente que contiene la muestra
y preparar las diluciones decimales por uno de los mtodos
recomendados en la seccin sobre preparacin y dilucin
de la muestra, utilizando como medio de dilucin la
solucin amortiguada de fosfato.
Efectuar las siguientes determinaciones de acuerdo a la
metodologa descrita en la presente gua de trabajos
prcticos.
Numeracin de microorganismos aerobios viables a 35 C
por 24-48 horas y a 20 C por 72 horas.
Numeracin de coliformes y coliformes fecales.
Numeracin de enterococos.

ANLISIS
MICROBIOLGICOS DE
LOS PRODUCTOS
ENLATADOS

Aerobios
Esporulado
s

OS
SM DE
I
AN OS
G
R NT
O
O IME JA
R
IC AL BA
M
Z
E
N
E ID
AC

OS
SM TOS
I
AN EN
G
R LIM
O
A
O
R
IC
M
S
O
N
E ID
AC

Anaerobios
Esporulado
s

Levaduras

Bacterias
Esporulada
s
Bacterias
No
Esporulada
s

Mohos

Los ms difundidos son los del


gnero Bacillus, que tiene su
origen en el suelo y agua, por lo
que casi siempre estn presentes
en
las
materias
primas
empleadas en conservas.
Los
anaerobios
esporulados
proceden
principalmente
del
suelo, por lo que se encuentran
ampliamente distribuidos en la
leche,
hortalizas
y
otros
productos alimenticios. Tambin
es posible encontrarlos en la
carne, ya que algunas especies
tambin se desarrollan en los
intestinos del hombre y animales.
El gnero ms importante es el
Clostridium

MARCO
TEORICO

Existen
microorganismos que se
forman de acuerdo al pH
del alimento

Grupos
segn
grado de
acidez

Rango de
pH

grupo 1:
poco
cidos

>5

Grupo 2:
semiacido
s

Grupo 3:
cidos
Grupo 4:
muy
cidos

4,5 < pH
<5.0

Grupos de
alimento
productos
crnicos ,
productos
marinos, leche
hortalizas
mezclas de
carne y
vegetales ,
sopas, salsas

aerobios esporulados , anaerobios


esporulados , levaduras, mohos y
bacteria no esporuladas

3,7 <
pH<4,5

tomates, peras,
higos , pias,
otras frutas

bacterias esporuladas, bacterias no


esporuladas, levaduras, mohos

pH<3,7

escurtidos,
pomelo, zumos
citricos

Microorganismos

EQUIPOS
MATERIALE
S

Vstago de
metal con
punta en unos
de los
extremos.

Escobilla.

Potencimetr
o.

Detergente.

Alcohol,
etlico 70%.

Abridor de
latas.

Mechero
Bunsen

Incubadoras
reguladoras
de 35 y a
55.

Muestras
de
enlatados

Embudo de
vidrio.
Cuarto estril o
cubculo de
siembra estril o
cabina de flujo
laminar.

Placas petri
estriles (100
x 15 mm)

Pipetas
graduadas
de 10ml.
Microscopio
.

Parafina
estril.

Solucin de
bicloruro de
mercurio de
1: 1,000.

Medios de
cultivo
Medios para alimentos de PH <
4.6 (baja acidez).

aerobios: Tubos de 200 x 25 mm


conteniendo 50 ml de caldo- cerebro
corazn con 0.1% de almidn soluble
anaerobios: Tubos de 200 x 25 mm
conteniendo 50 ml de caldo- cerebro
corazn con 0.1% de almidn soluble y
0.05% cisteina
Medios alternativos:
Tubos de 200 x 25 mm con 50 ml de medio
de cultivo PE-2(para aerobio y anaerobios).

Medio para alimentos <


4.6 (cidos).

para bacteria y hongos:


Tubos de 200 x 25 mm
conteniendo 50ml de medio de
carne de naranja.
bacterias cido lctico: Tubos
de 200 x 25 mm conteniendo
20 ml de contenido de caldo de
APT.

Brewer
Para microrganismos
anaerobios

Placas con
agar
Casoy
Para microrganismos aerobios

EXAMEN EXTERNO
PRELIMINAR.
Aqu adems de anotar el nmero del lote, dimensiones de la lata y
peso; se realizar la inspeccin visual del recipiente para detectar
la presencia de defectos mecnicos, integridad de las saturas,
preformaciones, corrosin, abolladuras u otras anormalidades que
pueden ser tiles en los hallazgos bacteriolgicos.

Dimensiones

INCUBACIN
PRELIMINAR.
Incubar las latas aparentemente normales segn las condiciones del PH del producto,
de acuerdo a la tabla de rangos normales de PH de alimentos enlatados.

Alimentos de PH < 4.6:


(cidos y altamente cidos)
incubar a 55C por 7- 10
das

Alimentos de PH > 4.6: (mediana y baja


acidez) incubar a 35C - 50C por 10 a 21
das.
NOTA: las conservas de carne que llevan
harinas o almidones como ingredientes,
incubar adems a 55C.

pH: 3,0- 3,4


pH : 6,46,8

PREPARACIN DE LA
LATA.
1. Retirar la etiqueta lata.
2. Lavar con agua jabonosa y con escobilla, enjuagar con abundante agua limpia y
secar.
3. Colocar entre dos hojas de papel de filtros limpios para detectar cualquier prdida
del producto durante la incubacin.
4. Incubar las latas a la temperaturas indicadas, durante el periodo de incubacin
preliminar, agitar las latas cada 2 das separar las que presenten manifestacin de
crecimiento, que se traducen por abombamiento o microfugas y proceder a su
examen como lata alterada.
5. Si al trmino del periodo de incubacin, las latas no presentan signos de alteracin
realizar control de esterilidad

Productos no
cidos
Productos
cidos
incuba

incuba
55 C por 7-10
das

35C por 10
das

Abombamiento
o fuga

No hay
alteracin

Se examina y se
control las latas
alteradas

Se realiza un
control de
esterilidad

CONTROL DE
ESTERILIDAD
las lat
as

no pre
senta
n sign
os de
altera
cin

1.Efectuar el examen de los alimentos enlatados en atmsferas estriles tomando todas


las precauciones de asepsia.
2.Desinfectar la tapa de lata (por el lado que no lleva impreso el cdigo), cubriendo con
alcohol al 70%, dejando por contacto de 10- 15 minutos, luego escurrir el exceso de
alcohol y flamear.
3.Abrir con abrelatas estril y eliminar totalmente la tapa, reemplazando inmediatamente
con la base de una placa petri estril.
4.Transferir 5 gr o ml de muestra a tubos con medio de cultivo apropiados por triplicado
para incubacin aerbica y anaerbica, adicionar a estas ltimas parafinas estriles.

5. Incubar a las mismas temperaturas de incubacin preliminar, as, si las


muestra han sido incubadas a 35C, incubar los tubos a 35C por 48 horas
hasta 5 das, si han sido incubabas a 55C, incubar los tubos a 55 C por 48
horas por 5 das.
6. Efectuar la coloracin Gram de la muestra, para el examen de microscopia,
si en el examen microscpico, se observa un nmero elevado de
microorganismos por campo (ms de 3) excepto en productos obtenidos por
fermentacin, indica psima condiciones de higiene durante la elaboracin del
producto y/o utilizacin de materias primas contaminantes. Adems, medir el Ph,
observar el aspecto, color y anotar otras caractersticas
7. Despus del perodo de incubacin, examinar los tubos, si hay desarrollo,
Realizar coloracin Gram y observar al microscopio, si es necesario hacer
subcultivos sobre agar Casoy , para aerobios y sobre agar para anaerobios
segn BREWEN , incubar a las temperaturas adecuadas .
Interpretacin
Considerar si un tubo es estril si un tubo aerobio como mximo demuestra
desarrollo.

5 g o ml de
muestra

5 g o ml de
muestra

Parafinas
esteril

Medios para
aerobios

negativo
Estril

Medios para
anaerobios
Si mas de un
tubo presenta
desarrollo
positivo
Coloracin
Gram

ANLISIS DE LATAS ALTERADAS


Desinfectar una de las tapas de la conserva (por el lado que no lleva impreso el cdigo), con una
solucin de bicloruro de mercurio al 1/1000, dejar actuar durante 10- 15 minutos. Retirar el agente
sanitizante y secar (no flamear las latas hinchadas).
Colocar la lata sobre un recipiente con desinfectante.
Cubrir la lata con un embudo estril invertido.
Introducir por la parte tubular del embudo un vstago metlico con la punta hacia la lata y realizar un
orificio en la parte central de la tapa a fin de eliminar el gas.
Proceder a la apertura de la lata usando un abrelatas estril.
Inmediatamente despus de abierta la lata cubrir con la base de una placa de Petri estril.

Transferir aproximadamente 5 g o ml de la muestra a 4 tubos con medios de cultivos para aerobios


y a 4 tubos con medios de cultivo para anaerobios, agregar parafina estril a los ltimos tubos.
Efectuar coloraciones Gram del producto y observar al microscopio. Si se observa bastones
positivos esporulados, la alteracin de la conserva se debe a un subprocesamiento. Si se observa
presencia de bastones, cocos, levaduras, indican que la alteracin es por microfugas.
Incubar la mitad de los tubos, aerobios y anaerobios a 35 por 48 horas hasta 5 das y la otra mitad a
55C por 48 horas hasta 5 das.
Hacer sub cultivos en placas de agar Casoy para aerobios y agar Brewer para anaerobios.
Incubar a 35C o a 55C por 24 horas segn el caso.
A partir de las colonias aisladas, realizar el bacteriograma diferencial, segn el esquema propuesto.

Gracias

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