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INMUNOLOGIA ESPECIAL

LABORATORIO DE
INMUNOLOGIA Y METODOS
DE INMUNOENSAYO

PALOMINO LLERENA, JULIO CESAR

QUE ES UN LABORATORIO
CLINICO?

Es el lugar donde se realizan anlisis


clnicos que contribuyen al estudio,
prevencin, diagnstico y tratamiento de
los problemas de salud de los pacientes

DOS TIPOS DE LABORATORIOS


CLINICOS
1.

LABORATORIOS DE RUTINA: tiene 4


departamentos bsicos
Hematologa
Inmunologa
Microbiologa
Qumica Clnica

ORGANIZACION DEL
LABORATORIO
Inmunologa: realiza pruebas sobre

anticuerpos que revelan la actividad y


presencia de microorganismos en el cuerpo

ORGANIZACIN DEL
LABORATORIO
Podemos organizar el laboratorio en
distintas reas de trabajo.
Sala de espera y recepcin: se recibe
a los pacientes
Toma de muestras: esta es la zona
donde se toman las muestras a los
pacientes, para luego distribuirlas a las
diferentes secciones del laboratorio

ORGANIZACIN DEL
LABORATORIO

rea de preparacin de medios y


cultivos

Zona de lavado y esterilizacin de los


materiales

EQUIPOS DEL LABORATORIO


CLINICO

Microscopio
Centrifuga
Balanza Analtica
Espectrofotmetro
Esterilizadores

PARTES DE LA
CENTRIFUGA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Tapadera
Cmara
Base
Interruptor de
encendido
Marcador de tiempo
Tacmetro
Freno
Control de velocidad

CENTRIFUGA

BALANZA ANALITICA

PARTES DEL
ESPECTROFOTOMETRO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Chasis
Porta cubeta
Selector de filtro
Selector de modo
Ajuste grueso
Selector de longitud
de onda
Indicador de longitud
de onda
Pantalla

ESPECTROFOTOMETRO

ESTERILIZADORES

Principios de los Mtodos Serolgicos


Reaccin Antgeno-Anticuerpo
La reaccin entre un antgeno y un anticuerpo
dirigido especficamente contra l da lugar a un
complejo antgeno anticuerpo

Utilizada ampliamente en los laboratorios para


la deteccin y cuantificacin de gran cantidad
de sustancias en diversos medios biolgicos.

Reacciones de
Aglutinacin
Cuando
el antgeno libre o unido a un soporte se enfrenta al anticuerpo,
el complejo antgeno-anticuerpo resultante se observa como una
aglutinacin
El proceso tiene dos fases: unin reversible y aglutinacin por formacin
de puentes entre los anticuerpos IgG divalentes o IgM multivalentes y los
antgenos
Dan fenmeno de prozona (aglutinacin aparente por exceso de
antgeno o anticuerpo sin aglutinacin

Reacciones de Aglutinacin Directa


Para deteccin de antgenos
Soporte particulado con anticuerpos adsorbidos
Distintos tipos de tcnicas segn la naturaleza fsica de soporte
Aglutinacin al ltex: partculas de ltex fcilmente visibles
Deteccin en LCR de antgenos de Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus agalactiae

Reacciones de Aglutinacin Directa


Para deteccin de anticuerpos
Se pueden hacer en tubo, portaobjetos,
placa o pocillo de microplaca
Se enfrentan las partculas microbianas
(generalmente muertas) en suspensin
con el suero del paciente.
Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a la bacteria, se forman
agregados visibles en el fondo del tubo o en el porta o en fondo de la
microplaca.

Reacciones de Aglutinacin Indirecta


Para deteccin de anticuerpos
Se adsorben los antgenos en un elemento partculado (partculas de
ltex, gelatina o bentonita, o clulas como hemates humanos, ovinos
o de pavo
Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo,
porta o pocillo de microplaca

Reacciones de Inhibicin
Basadas en la incapacidad de algunos microorganismos para realizar
determinadas actividades biolgicas en presencia de anticuerpos
especficos. Las mas utilizadas son dos:
Inhibicin de la Hemaglutinacin
Esta aglutinacin puede ser inhibida por la presencia de anticuerpos
especficos en el suero del paciente
Neutralizacin
Algunos virus (poliovirus) no desarrollan su efecto citoptico habitual en
clulas de cultivo celular cuando hay presentes anticuerpos especficos.

Pruebas de Fijacin de Complemento


Se incuba suero del paciente con el antgeno. En presencia de anticuerpos
en el suero se forman complejos antgeno-anticuerpo.
Se aade una cantidad de complemento (todos los elementos).
Si inicialmente se haban formado inmunocomplejos se produce la
activacin del complemento , consumiendo todos los componentes del
sistema. Si no hay inmunocomplejos todo el sistema permanece.
Se agrega un sistema revelador constituido por hemates unidos a
anticuerpos antihemates (hemolisina)
Si hay complemento libre (ausencia de anticuerpos en la muestra) se fija a
los complejos hemate-hemolisina y los eritrocitos Se lisan.

Reacciones de
Precipitacin
Formacin de estructuras insolubles por unin ente el antgeno soluble y
el anticuerpo especfico incapaces de permanecer en solucin
El precipitado puede ser puesto de manifiesto mediante tcnicas de
nefelometra o inmunoturbidimetra.

Inmunodifusin doble
Se enfrentan concentraciones conocidas de antgeno soluble con un
antisuero problema en un medio gelificado
Tras un perodo en el que se permite difundir a ambos elementos
puede observarse en el caso de que existan anticuerpos, bandas de
precipitacin que pueden ser identificadas a simple vista o mediante
tincin proteica.

Inmunodifusin Radial
Se disuelve el anticuerpo en el agar y se colocan en pocillos
diluciones del antgeno.
Si se corre simultneamente una curva patrn puede cuantificarse
por regresin la cantidad de antgeno.
Es mas til para para la deteccin de antgenos que de anticuerpos

Contrainmunoelectroforesis
Puede ser utilizada tanto para detectar antgenos como anticuerpos
Combina la electroforesis (migracin de antgenos y anticuerpos en un
gel de agarosa por accin de un campo elctrico) con la precipitacin
(formacin de lneas de precipitado en un gel de agarosa cuando se
produce la reaccin antgeno-anticuerpo).

Pruebas con Anticuerpos Fluorescentes


Se utilizan anticuerpos conjugados con sustancias fluorescentes
(fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceina o el naranja de
acridina.
Se observa la presencia o ausencia de fluorescencia observando con un
microscopio de fluorescencia
Dos variantes:
Tcnica directa (para deteccin de antgenos): se fija la muestra en un
portaobjetos con acetona, se agrega el anticuerpo marcado con el
florocromo (inmunofluerescencia directa IFD).
Tcnica indirecta (para deteccin de anticuerpos): se agrega primero el
suero del paciente sobre antgeno improntado en portaobjetos; en la
segunda fase se incuba con anticuerpo anti humano marcada con
fluorocromo (inmunofluorescencia Indirecta IFI)

Inmunohistoqumica enzimtica
Se usa el tejido del paciente, al que se le agrega anticuerpos marcados con
enzimas.
Se revela el marcador y se observa la presencia o ausencia de color.
Usado para detectar antgeno, en ocasiones post mortem, por ejemplo
pacientes infectados con Rabia

Inmunoensayos
Para detectar antgenos Metodologa ELISA
Utilizan anticuerpos de captura pegados a un elemento fijo, portaobjetos,
esfera de poliestireno, pocillo de microplaca, etc.

Inmunoensayos
Para detectar anticuerpos Metodologa ELISA
Utilizan antgenos unidos a un elemento slido
(esfera de poliestireno, pocillo de microplaca al
que se le aade suero del paciente.
Si el suero tiene anticuerpos especficos se unen a Los antgenos.
La reaccin se revela mediante un segundo anticuerpo conjugado con:
Enzima
Enzimoinmunoensayo (EIA)
Istopo radioactivo (I125)
Radioinmunoensayo (RIA)
Sustancia fluorescente
Fluoroinmunoanlisis (FIA)
Se lee la seal con un espectrofotmetro (EIA), contador de centelleo (RIA)
o un fluormetro (FIA)

TECNICAS DE
INMUNOENSAYO

Se utilizan ENZIMAS como marcadores


inmunoqumicos, que permiten detectar
las uniones primarias antigenoanticuerpo.
Las enzimas son molculas estables,
econmicas.
Son fcilmente conjugables con
anticuerpos o con antgenos.

La intensidad de la coloracin o de la
inmunofluoresencia es proporcional a la
cantidad de elemento analizado
presente en la muestra.

ENZYMED LINKED INMUNOSORBENT ASSAY

TECNICA DE ELISA

VENTAJAS

Mtodo sensible.
Bajo costo.
Fcil manejo.
Permite desarrollar un gran nmero de
muestras en un corto perodo de
tiempo.
Buen equilibrio entre sensibilidad y
especificidad.

ETAPAS DE LA TECNICA
ELISA
MUESTRA CON
ANTICUERPO
O
ANTIGENO

FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO

CONJUGADO DE
AG O AC
CON ENZIMA

INCUBACION

LAVAR

FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO

S
U
S
T
R
A
T
O

I
N
C
U
B
A
R

FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO Y
CONJUGADO

LAVAR

FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO Y
CONJUGADO

FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO Y
CONJUGADO
COLOREADO

COMPONENTES DEL KIT DE ELISA


SOL.
DILUYENTE
SOL.
STOP
PLACA
CON
FOSITOS

SOL.
SUBSTRATO

CONTROLES

CONJUGADO

MATERIALES Y EQUIPO
PUNTAS DESCARTABLES

MICROPIPETAS

ESPECTROFOTOMETRO

RECOMENDACIONES

MANTENER UN CONTROL ESTRICTO


DEL TIEMPO EN CADA INCUBACIN
Y RESPETARLO!!!!
Colocar la cantidad exacta de reactivo y
muestra a analizar.
No deben haber burbujas de aire en las
puntas ni en los fositos de la placa.

MODO CORRECTO DE
UTILIZAR LA MICROPIPETA

TIPOS

ELISA INDIRECTO
DETECCION DE
ANTICUERPOS

La reaccin se lleva a cabo en los


fositos de la placa, donde se adsorbe el
antigeno conocido, con el suero
problema.

La actividad enzimtica sobre el sustrato


apropiado, aadido al final de la reaccin,
se revela por cambio de color cuantificable
por espectrofotometra, la intensidad es
proporcional a la cantidad de
antiinmunoglobulina marcada captada, que
a su vez es proporcional a la cantidad de
anticuerpos presentes en el suero
problema.

ELISA COMPETITIVO

Puede utilizarse para la determinacin


de anticuerpos o de antigenos.

ANTICUERPOS

Se establece una competencia entre los


anticuerpos del suero problema y UN
ANTICUERPO SECUNDARIO
(conjugado).

La muestra se incuba con el antigeno


conocido para la formacin de los
inmunocomplejos.
Luego se agrega el conjugado que
contiene un anticuerpo especifico
secundario MARCADO
ENZIMATICAMENTE.

Este anticuerpo se unir a el antigeno


libre del fosito. (SUEROS NEGATIVOS)

Esta reaccin es la que se colorea.

POR LO TANTO LAS MUESTRAS


POSITIVAS NO TOMAN NINGUN
COLOR PORQUE LA ENZIMA NO SE
LIGA AL COMPLEJO ANTIGENO
ANTICUERPO QUE SE FORM.

ELISA DIRECTO

CAPTURA DE ANTIGENO
SANDWICH

En la placa de poliestireno se encuentra el


anticuerpo especifico para detectar el
antigeno en la muestra.

La solucin de conjugado contiene la


enzima ligada con un segundo anticuerpo
especifico conocido que se une por otro
epitopo al antigeno.

El antigeno queda capturado en una


especie de SANDWICH.
El cambio de color al agregar el sustrato
demostrara la presencia del antigeno.
La intensidad de la reaccin cromtica
se relaciona directamente con la
cantidad de antigeno.