PCR

(Polymerase Chain Reaction)

Objetivo de la tcnica
Generar muchas copias de un DNA
especfico a partir de un mnimo.
Aplicaciones:
-clonamiento.
-deteccin de enfermedades infecciosas.
-filogenia.
-deteccin enfermedades hereditarias.
-etc

Qu componentes requiere la reaccin?

El DNA templado
Oligonucletidos o primers o partidores, que son
mono-hebras de DNA complementarias a los extremos
del segmento de DNA que se quiere amplificar.
Usualmente tienen entre 18-50 nucleotidos.
Una DNA polimerasa, estable a altas temperaturas.
dNTPs
Buffer apropiado (Mg++).
Termociclador

Denaturacin
3 min

15 seg
94 oC

Elongacin

F.I
1-1,5 min

10 min

72 oC
30 seg
55-60 oC

Alineamiento

Amplificacin

72C
Elongacin final

Etapas de la reaccin
Fase Inicial: T 94-98C por 2-10min denaturacin DNA y
activacin de enzima
Amplificacin: consta de varios ciclos (20) en los que se
repiten 3 pasos
1. Denaturacin: Ciclo corto a una temperatura alta
Temperatura separacin de doble hebra
2. Alineamiento: formacin de puentes de hidrgeno entre
los oligo (primers) y las hebras del DNA molde, se logra por
enfriamiento luego de la denaturacin y depende de la
temperatura de fusin de los oligo
3. Elongacin: Enzima (Taq pol) se une a la hebra alineada
con el Oligo y comienza a adicionar los deoxinucletidos . La
temperatura de este proceso depende de la enzima a utilizar
Elongacin final : Asegura que todas las hebras sean
(72C)
elongadas (72C 3-10 min)

 En cada ciclo se duplica el nmero de hebras de DNA

El nmero de amplificaciones es:
(2n 2n)x, donde n es el nmero de ciclos y x el nmero de
molculas de DNA iniciales. Esto implica 1 billn de copias luego
de 20 ciclos

Y si se amplifica por un numero de

ciclos infinitos??
El sistema posee una eficiencia mxima efecto
plateau
Este efecto ocurre por:
Agotamiento de los reactantes
Re-alineamiento entre
productos
Dao en la polimerasa

Amplificacin de productos
no deseados

Qu caractersticas tiene un buen

partidor?

specificidad: Largo del partidor y composicin de las bases

Estabilidad: se debe evitar la formacin de doble

hebra inter e intra partidor. Para ello se debe tomar
en cuenta la temperatura de hibridacin, temperatura
de fusin y la estructura interna del partidor.
Compatibilidad: Ambos partidores deben ser
compatibles en la condiciones del PCR.

Especificidad

El partidor se debe unir slo en

un lugar de la secuencia a amplificar
Largo del partidor : a mayor largo mayor
especificidad , pero aumenta la temperatura
de alineamiento (hibridacin). En general
largos mayores de 15 pb aseguran
especificidad. largo usado 17-28 pb.
Temperatura de fusin (Tm) : T a la cual el 50%
de las hebras de DNA se encuentra como hebra
simple
Depende del largo de la secuencia y del contenido
de GC (40-60%)
Tm ideal 52-65C

Temperatura de hibridacin: T a la cual el

partidor se alinea con la secuencia blanco en el DNA
templado.
Se calcula a partir de la Tm
T hibridacin: Tm 4C
Si T hibridacin muy alta Baja hibridacin.
Si T hibridacin muy baja hibridacin inespecfica.

Estabilidad

partidor disponible para la

reaccin de tal manera que la eficiencia de la
reaccin no disminuya

Compatibilidad

en la reaccin se utilizan 2
partidores uno forward y otro reverse que deben ser
concordantes.
La caracterstica ms crtica es que la temperatura
de hibridacin no difiera ms all de 3 C entre los
partidores
Crtico contenido de G+C similar

Resumen del diseo de

partidores
1. Especificidad
2. Largo: 17-28 bases. Este rango puede variar
3. Composicin de las bases: promedio del contenido de
(G+C) alrededor de 45-60%; evitar tramos largos de
(A+T) y (G+C);
4. Optimizar la hibridacin: es crtico que la estabilidad de
la hibridacin del 5 de los partidores sea alta y la del
3relativamente baja para evitar la hibridacin
incorrecta
5. Tm entre 55-65 C;
6. Asegurar que la pareja de partidores tenga una Tm
similar (mx 2 3 C de diferencia).
7. Minimizar la estructura secundaria interna entre
partidores.

PCR mimic
Mtodo desarrollado por: Buzas y Cox, 1997 Quantitative analysis of mu
and delta opioid receptor gene expression in rat brain and peripheral
ganglia using competitive polymerase chain reaction Neuroscience,
76(2):479-489

Sirve para cuantificar el DNA o RNA a partir de una reaccin de PCR, en la

que se incluye un DNA competidor de concentracin conocida.

DNA blanco

DNA mimic

540pb

Log 10 [pixeles fragmento

TH/pixeles competidor]

0.50

0.25

-0.25

0.25

0.50

-0.25

-0.50

Log10 [competidor]

0.75

1.00

http://rsb.info.nih.gov/ij/

Image J