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DETERMINACIN DE

INHIBIDORES DE
PROTEASAS EN EXTRACTOS
DE LEGUMINOSAS Y SU
EFECTO SOBRE PROTEASAS
ENDGENAS DEL MUSCULO
DE PESCADO

Fenmeno MODORI
La incubacin de las Pastas de
Protena de Pescado a 60 C induce
una:
disminucin de las PROPIEDADES
MECNICAS de los GELES DE
provoca la
PESCADO
disminucin
del VALOR
COMERCIAL

Existen 3 Hiptesis sobre el origen del


fenmeno
MODORI:
1.

2.

3.

La coagulacin de la protena
Miofibrilar durante el calentamiento a
60 C.
La degradacin de la miosina causada
por una proteasa alcalina que acta a
una temperatura ptima de 60 C y pH 7.
Protenas de carcter no enzimticas
cuya presencia induce al Fenmeno
MODORI.

Se ha comprobado la existencia de una Proteasa


Alcalina, ESTABLE al Calor

La cual afecta
a ciertos tipos
de surimi
Provocando una
degradacin
Textual cuando la
pasta CRNICA se
calienta
alrededor de 60
C

Existen diferencias en PESO MOLECULAR y


TIPO DE ENZIMA, dependiendo de la especie
de Pescado:
CISTEN Carpa
PROTEASA de:
Peso molecular
(Carpinus carpio)

Roncador Blanco
(Genyonemus
lineatus)
Roncador del
Atlntico
(Pomadasys croco)

superior a los
400 KDa

CISTENPROTEASA
considerablement
e pequea con un
Peso molecular de
32 Kda, y
CONDICIONES
PTIMAS DE
ACTIVIDAD a 55 C
y pH 6.5 7.0

Sin embargo:
Roncador Los inhibidores de
del Atlantico Tripsina
muestran eficiencia
la
Sugiriendo que la previniendo
ENZIMA responsable
degradacin
podra ser una Sern-Proteasa.
proteoltica de ste.
Se ha identificado
Croca los 2 tipos:
Blanca Sern y
Cistenproteasas, en el

Sern y
Cistenproteasa
stas pueden ser
ACTIVADAS : Cistena y 2-mercaptoetanol
DESACTIVADA : cido 4-cloromercuribenzoico (PCMB)
cido etilndiamino tetractico (EDTA)
cido etilenglicol-bis-N,N-tetractico
(EGTA)
N-etilimaleimida (NEM)
N-bromosuccinimida (NBS)
2-metil-1,4-naftoquinona (K3)
UREA ( CH4N2O)

Al someter la Pasta de
Surimia T de 80 C,
antes de 60 C
OBS: La INHIBICIN
del F.M.
Probablemente: Por
la INACTIVACIN
TRMICA de las
Enzimas
PROTEOLTICAS.

ACTUALMENTE:
El control de la Protelisis de la
MIOSINA se realiza adicionando:
SUERO de BOVINO
INHIBIDORES CLARA DE HUEVO
Extractos de PAPA o
de PROTESAS
ARROZ
[ ] de SUERO QUESERO
mejores aditivos como:

LEGUMINOSAS

LEGUMINOSAS
Contienen INHIBIDORES
de
SERN-PROTEASAS
Pts. a la fam.
Inhibidor de KUNITZ

BOWMAN-BIRK

TRIPSINA
TRIPSINA
(Peso molecular : 21 KDa) y QUIMOTRIPSINA
(Peso molecular :8.3 KDa)

ELABORACIN DEL SURIMI


Materiales:

Lenguado
Croca
Recipientes de acero
Desespinadora mecnica
Filtro con tela de algodn
Mezcladora
Bolsas de polietileno
Un viscosmetro Brookfield
modelo 5XHBTD
Congelador de placas

PROCEDIMIENTO
Usar la tcnica descrita por Montejano y Morales
Eviscerar el pescado, descabezarlo y lavarlo en agua fra.

Introducirlos en una desespinadora mecnica con orificios de


tambor de 5mm de diametro.
Lavar la pulpa del pescado 3 veces en recipientes de acero
inoxidable en agua a una temperatura menor a 10C empleando
una porcin 3:1(agua : pulpa de pescado)
En la tercera lavado adicionar 0.1%de NaCl

Agitar en forma continua durante 10 minutos


Eliminar el agua a travs de un filtro con tela de algodn.
Incorporar 8% de sacarosa como crioprotector con el
uso de una mezcladora.
Empaquetarlas en bolsas de polietileno y congelarlas a
-30C por 3 horas en un congelador de placas.
Por ultimo almacenarlo a -20C hasta su uso.

LUEGO DE LA PREPARACION
Embutir la pasta de surimi en tubos de acero inoxidable con tapa
rosca, hacerlo con la ayuda de una embutidora manual.
Incubar los tubos a 60C durante 30 minutos, luego llevarlos a
coccin a 90C durante 15 minutos.
Monitorear la temperatura del centro del gel utilizando un
termmetro de aguja en un tubo control.
Luego de la coccin llevar los tubos a agua fra y posteriormente
llevarlos a refrigerar 24 horas, antes de desmoldar los geles.
Despus de desmoldarlos almacenarlos a -4C durante 48 horas
hasta realizar el anlisis de la textura de torsin.

OBTENCION DE LOS GELES

Se obtendr:

Solubilizando el surumi con


2.5% de cloruro de sodio en
una cortadora de carne
durante 5 minutos
mantenindola a una
temperatura de 0 a 4C

PRUEBA DE TORSIN
- Para

esta prueba sacamos los geles y los aclimatamos a una temperatura de ambiente
durante 2 horas.
- Cortarlo en segmentos de 2.8cm de longitud y darles forma de un reloj de arena.
- Analizar los geles con el viscmetro Brookfield modelo 5XHBTD con un dispositivo
especial.
- En esta mquina el gel va a ser sometido a una fuerza rotacional a una velocidad de
giro de 2.5rpm
- La prueba terminar cuando el gel se fracture.
- Se utilizar los valores de unidades Brookfield de torque UB y la distancia
proporcional al nmero de giros, registrados en el graficador sern utilizados para
calcular el esfuerzo y la deformacin al corte, aplicando un factor de correccin.

Ecuacin:

t = 1580UB
Donde UB = Unidades Brookfield
valores de deformacin del corte se calcula con la ecuacin

g = 0.15 ( D/V ) 0.00848 (UB)

Donde:
g = deformacin al corte ( adimensional )
D = Distancia en el graficador desde inicio de giro hasta la fractura.
V = velocidad de movimiento del papel en el graficador ( cm/s)
si los valores de deformacin del corte son mayores a 1.0 se realiza una
correccin usando una ecuacin citada por Hamman y MacDonald

Si los valores de deformacin del corte(g) son mayores de


1.0 se realiza una correccin usando una ecuacin citada
por Hamman y MacDonald:

g = ln( 1 + g3/2 + g( 1 + g2/4)1/2)

4- Determinacin de actividad proteoltica a 60


C en surimi mediante el mtodo de pptidos
solubles en cido tricloroactico
1. Para
determinar
la
actividad
proteoltica
se
Introdujeron 700 mg de surimi crudo en tubos de
ensaye de 13 x 100 mm Se adicionaron 0.2 mL de
solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7 y se
homogeneizaron
2. A continuacin las muestras se incubaron a 60 C
por 2 horas para establecer la presencia de
protelisis
3. La reaccin se detuvo con la adicin de 2mL de cido
tricloroactico (TCA) al 5%. Despus de homogenizar,
las muestras fueron centrifugadas a 840xg por 5
minutos a temperatura ambiente.
4. Se determin la presencia de pptidos solubles en
cido tricloroactico en el sobrenadante como un
color blanquecino.

5- Obtencin de los extractos crudos de


leguminosas
Los inhibidores de proteasas fueron obtenidos de:
alubia, chcharo, garbanzo y soja, provenientes del
comercio local. Los extractos se obtuvieron de acuerdo
a
la tcnica de Garca-Carreo et al. (1996a). Las
semillas fueron pulverizadas en un vaso de licuadora.
Posteriormente se mezcl 1 g de sta harina de
leguminosa por cada 3 mL de solucin amortiguadora
de NaH2PO4. El homogeneizado se mantuvo en
agitacin por 2 horas a temperatura ambiente, para
posteriormente almacenarlo a 4 C por 22 horas. Los
extractos crudos fueron extrados centrifugando dos
veces a 840 x g por 10 y 30 minutos, filtrando en cada
tiempo de centrifugacin. Posteriormente se
almacenaron a 4 C.

6- Caracterizacin de los inhibidores de


proteasas presentes
Se determin el efecto inhibidor especfico de los
extractos de leguminosas con extractos enzimticos
de tripsina tipo III de pncreas de bovino,
quimotripsina tipo II de pncreas de bovino y papana
de ltex de papaya, los cules fueron preparados en
concentracin de 1 g/L en solucin amortiguadora de
NaH2PO4.
La especificidad de los inhibidores de proteasas fue
determinada mediante una modificacin del mtodo
propuesto por Garca-Carreo et al. (1996a). Se
adicionaron 0.4 mL de extracto enzimtico en tubos de
ensaye 13 x 100 mm.

A las muestras en que se determin actividad proteoltica se


les adicion 0.2 mL de solucin amortiguadora de NaH2PO4.
Para el ensayo de inhibicin,la solucin amortiguadora de
NaH2PO4 fue reemplazada por 0.2 mL de extracto de
leguminosa (disuelto en la misma solucin). Las muestras
fueron incubadas a 25 C durante 30 minutos, para permitir
que actuase el inhibidor
.Como sustrato se adicion 0.4 ml de azocasena al 0.2%.
Posteriormente fueron incubados a 60 C durante 2 horas
para establecer la presencia de protelisis.
La reaccin se detuvo con 0.8 mL de TCA al 5%..Despus de
homogenizar, las muestras fueron centrifugadas a 840 x g
por 5 minutos a temperatura ambiente y se midieron a una
absorbancia de 366 n

7- Efecto de los extractos en la actividad


proteoltica a 60 C en surimi
Se introdujeron 700 mg de surimi en tubos de ensayo de 13 x 100
mm. A las muestras que se les determin actividad proteoltica. Se
les adicionaron 0.2 mL de solucin amortiguadora de NaH2PO4.
Para el ensayo de inhibicin, se reemplaz la solucin
amortiguadora de NaH2PO4 por 0.2 ml de extracto de leguminosa
(disuelto en la misma solucin). Las muestras se incubaron a 25 C
durante 30 minutos, para permitir que actuase el inhibidor.
Posteriormente se incubaron a 60 C por 2 horas para establecer
la presencia de protelisis. La reaccin se detuvo con la adicin de
2 ml TCA al 5%. Despus se determin la presencia de pptidos
solubles.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

La incubacin a 600C de los geles de Surimi de


Lenguado y Croca provoc una disminucin en los
valores de esfuerzo cortante y deformacin al corte,
respecto a la muestra control.
El detrimento de las propiedades mecnicas
aument por efecto del tiempo.
La importancia del Fenmeno Modori ha sido
asociado con la presencia de actividad proteoltica
a 600C.
La presencia de inhibidores en los extractos fue
confirmada empleando Tripsina, Quimotripsina y
Papana, teniendo azocaseina como sustrato.

La presencia de actividad proteoltica a 600C en


Surimi as como el efecto inhibitorio de los extractos
de leguminosas se determin midiendo la presencia
de pptidos solubles en TCA al 5%.
Los inhibidores de proteasas presentes en los
extractos crudos de leguminosas podran emplearse
para inhibir la actividad proteolitica en productos de
pescado.