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Procesos Biolgicos

Doctorado en Biotecnologa
USCAH

ygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in

TM. Gerardo Retamal


Bt. Camila Calfio

Introduction

El oxigeno generado en los cloroplastos durante la fotosintesis puede aceptar electrones a traves del pas
Afectan diversas funciones celulares como por ejemplo: dao a
cidos nucleicos, oxidacin de proteinas, peroxidacin lipidica, entre
otros. Estos daos generan respuestas como por ejemplo expresin
de genes. Lo cual sugiere que la clula tambin puede utilizarlo
como seales para la sntesis de algunas protenas relacionadas
con el control del estrs.
La regulacin debe ser rpida ya que las ROS viajan una corta
distancia para daar inpespecificamente diversas estructuras
celulares.

La acumulacion de ROS
inducida por estrs tiene
diversos mecanismos de
batalla por ejemplo: sistemas
enzimaticos, molculas no
proteicas y metabolismos
secundarios.

ROS chemistry
La aparicin del O2 en la atmsfera
permiti el metabolismo aerbico y la
generacin de energa eficiente, siendo el
O2 el ultimo aceptor de electrones, lo que
lleva a la formacin de ROS en las clulas.
Si bien el O2 atmosfrico es poco
reactivo, puede dar origen a diversas
ROS.

Superoxide radicals

El mayor sitio de production de ion


superxido es la membrana tilacoidal.

PSI

Cuando se oxida el citocromo c y una


oxidasa alternativa reacciona con el O2,
cuatro electrones son transferidos, y hay
liberacin de agua. Sin embargo algunas
veces el O2 puede reaccionar con otros
componentes de la CTD, aqu solo un
electrn es transferido, resultando
anin superxido.

ROS chemistry
El anin superxido
generado por la FS en
los cloroplastos puede
activar genes de
distintas vas de
sealizacin

Singlet oxygen

Insuficiente energia de
disipacin
Clorofila triplete

Salinidad
Las plantas de amaranto
pueden transformar el
anion superxido por SOD
y amarantina, reduciendo
la LPO

Es inusual por que no esta relacionado con la CTE

Reaccionar con 2O2 para dar origen


a un single

++
Estrs abitico
(salinidad, sequedad)

Cierre de estomas y
disminucion de la [CO2]

Dao al PSI y PSII, Proteinas,


lpidos

ROS chemistry
Mecanismos:
b-carotenos, tocoferol, quinonas

Rhodobacter sphaeroides
180 genes mediados por una subunidad sigma alternativa (sigmaE)
Arabidopsis
Activa genes de respuesta a estrs (H2O2)

Genes de respuesta a estrs oxidativo

Primeramente seria una seal y no un elemento txico

Hydrogen peroxide

Alta vida media 1ms


H2O2 puede inactivar enzimas oxidando los grupos tiol

Dao a las races, rpida senescencia de


Estudios en tricoma de Morus
las hojas
alba muestran que la
Aumento de H2O2
deficiencia de Cu agrava el
Aumento de enzimas como
estrs oxidativo
SOD, CAT

Altas [ ]
Muerte celular
Bajas [ ]
activar tolerancia a estrs biotico y abiotico

PERXIDO DE HIDROGENO

ROS chemistry

H2O2
Senescencia, fotorespiracin y fotosntesis,
movimiento de los estomas, ciclo celular, crecimiento
y desarrollo

Candidato a ser Segundo Mensajero:


relativamente larga vida media y alta
permeabilidad a travs de la membrana.

Hydroxyl radicals
En presencia de metales puede ser producto
del radical superxido y perxido

Altamente reactivo.
Dao a DNA, Lpidos, protenas

Ausencia de enzimas que lo eliminen

ROS production in different organelles


Mitocondria

Peroxisomas
Flavoproteinas y
Citcr b(ETC
membrana)

CTE es la primaria fuente de ROS


La produccin de ROS puede variar
en presencia de estrs

Xantina oxidasa
(matriz)

B-oxidacion de AG
Glicolato oxidasa

SO y H2O2

Cloroplastos
O2 generado puede llevar a la
produccin de ROS
triplete Chl
PSII
PSI

Seales a toda la planta

Complejos I y III
Produccin de SO H2O2

Fe

Cu

OH

Transpasar la
membrana

ROS
PCD mediada por
patgenos

Escape de O2 produciendo SO
Produccin natural de Oxigeno singlete

Frio
Regulacion de T
Eliminacion de ROS (SOD)

Produccion de ROS es
parte del metabolismo
normal de la clula

ROS and cell biochemistry


Lipid peroxidation (LPO)

El proceso mas daino en los organismos vivos


Aumenta bajo estrs abitico (salinidad, agua, sequedad)
Ocurre cuando ROS supera el umbral
Agraba el dao oxidativo, por los derivados de lpidos generado
Disminuyen la fluidez de la membrana
Aumenta la filtracin de sustancias extraas

Inactivar receptores, enzimas o canales ionicos


Dao a los genes

ROS and cell biochemistry


Protein oxidation

Proceso Irreversible

ROS (Ox. singlete e hidroxilo) atacan grupos


Tiol y proteinas sulfuradas

Produce proteolisis o aglutinacin de protenas

Carbonilacion de proteinas de reserva (ej:


semilla)

Alto en sitios con alto metabolismo

En condiciones de Estrs reacciona con


productos de LPO

ROS and cell biochemistry


DNA damage Generacin de dao espontneo al DNA

Os
Guanina

Purinas

OH
NO

Delecin de bases
Dimeros de pirimidina
Mellas en las hebras
Modificacin de bases
(alquilacion, oxidacin)

Pirimidinas

desoxiribosa

Membrana

Reduccin de sntesis de protenas

Fotosntesis

ROS scavenging
antioxidant defense
mechanism

ROS scavenging antioxidant defense mechanism


Superoxido dismutasa SOD

Clasificacin segn cofactores metlicos

Identificacin de las isoez en


base a su sensibilidad
KCN y H2O2 (inhibidores)

Sobrerregulacin SOD

Actividad SOD

Estrs oxidativo

Estrs abitico y bitico

Estrs salino
Estrs salino y sequa
Estrs por Cd,Cu y Al
Estrs hdrico
Intensa luz combinada con sequa
Irradiacin UVB

Importante Supervivencia de las plantas

Plantas transgnicas tolerantes


al estrs abitico
sobrexpresan diferentes
SODs
Aumenta la tolerancia a mltiples estrs

ROS scavenging antioxidant defense mechanism

Catalasas CAT

CAT convierte 6 millones

Detoxificacin ROS durante estrs

/ minuto

Elimina H2O2 producido en peroxisomas por las oxidasas (oxidacin ac.grasos,


fotorespiracin y catabolismo de las purinas)
CAT reacciona con algunos hidroperxidos (MeOOH)
Izoez CAT mejor estudiadas en plantas superiores ( ej. 12 izoez Brassica).
CAT E.coli sobreexpresada en O.sativa confiere tolerancia a estrs salino
Pretratar plantas de arroz con H2O2, aumenta la act.CAT y protege a las
plantas del estrs por Cd

Actividad CAT

Hojas y races de C. arietinum bajo estrs salino


Estrs por sequa en trigo
Alta luminocidad P. asperata bajo estrs sequa
Irradiacin UVB

Actividad CAT

Estrs NaCl y Cu (A. doliolum)


Estrs por sequa en arroz
Combinacin estrs por sequa y
salinidad

ROS scavenging antioxidant defense mechanism


Ascorbato peroxidasa APX

tAPX

gmAPX

Tilacoide

Memb. glioxisoma

Proteccin clulas en plantas


superiores

sAPX
Forma soluble
Estroma cloroplasto

cAPX
Citoslica

o Mayor afinidad por H2O2 (uM) v/s CAT (mM)


o Pretratamiento plantas de arroz con H2O2, aumenta la Act.APX y protege a las plantas del estrs
por Cd.
o Estrs leve por sequa existe una mayor Act. APX-cloroplastos, disminuye al aumentar el estrs.
o Sobreexpresin de APX en cloroplastos de tabaco mejora su tolerancia a salinidad y dficit
hdrico.
o 150 y 200 mM NaCl incrementa la expresin de sAPX8 y la actividad de APX (sin efecto en las
otras APX)
La sobreexpresin de APX en plantas
transgnicas confiere tolerancia al estrs
abitico.
Actividad APX

Estrs por Cd en B. juncea y T. aestivum


Estrs por salinidad A. doliolum
Estrs hidrico P. vulgaris y P. asperata
La sobreexpresin de CAPOA1 en tabaco
transgnico
mayor tolerancia al estrs oxidativo y resistencia
oomicetos

ROS scavenging antioxidant defense mechanism


Guaiacol peroxidasa GPOX

Descompone el cido indol-3-actico (IAA).


Tiene un papel en la biosntesis de la lignina.
Defensa contra estrs bitico por el consumo de H2O2.
Actividad de GPOX vara segn las especies de plantas y condiciones de estrs.

Actividad GPOX

* Estrs por Cd en T. aestivum y A.thaliana


* Aumento inicial en Picea sometidas a Cd.
* Estrs salino en teiidos de hojas y raz de
V. radiate y O. sativa

ROS scavenging antioxidant defense mechanism


Glutatin reductasa GR
Defensa contra el estrs oxidativo

o Importante en sistema de defensa contra ROS por mantener


el estado reducido de GSH.
o Se localiza en cloroplastos, tambin se ha encontrado en
mitocondria y citosol.
o GSSG consta de dos GSH unidas por un puente disulfuro
que se puede convertir de nuevo a GSH por GR.
o GR y GSH importantes en la determinacin de la tolerancia
de una planta bajo diferentes estrs.

Actividad GR

* Presencia de Cd en T. aestivum, A.thaliana, B. juncea.


Estrs salino en tejidos de hojas y raz de C. arietinum
Estrs por sequa en O.sativa
Alta luminocidad y sequa en P. asperata

Las plantas transgnicas que


producen GR son tolerantes al
estrs abitico.

ROS scavenging antioxidant defense mechanism


Monodehidroascorbato reductasa MDHAR
Se encuentra como Isoez. citoslica y cloroplstica.
Junto a APX, MDHAR se encuentra en los peroxisomas y mitocondrias
MDHAR no puede participar en la reduccin de la MDHA en el sistema
de barrido tilacoidales

Aumento Act. MDHAR


Pinus sylvestris expuestos a Cd
Estrs por sequa en plantas de arroz

Disminucin Act. MDHAR


Alamos hbridos (Populus x Canescens) expuestos a Cd

ROS scavenging antioxidant defense mechanism

Dehidroascorbato reductasa DHAR


Sobreexpresin DHAR mejora la tolerancia de las plantas frente a diversos tipos de estrs
abitico.
Plantas que sobreexpresan DHAR muestran tolerancia al estrs por Al con un alto nivel
ASH.
Sobreexpresin de DHAR en tabaco protege a las plantas contra la toxicidad del ozono.

La sobreexpresin de DHAR incrementa la tolerancia a la salinidad en Arabidopsis.

Actividad DHAR

o Aumenta la tolerancia al fro del tomate


o Sobreexpresin en tabaco transgnico
mayor tolerancia estrs salino y osmtico.

ROS scavenging antioxidant defense mechanism


Glutatin S-transferasa GST

desintoxicacin
de herbicidas

homeostasis
hormonal

desintoxicacin
hidroxiperxido

metabolismo de
la tirosina

regulacin de la
apoptosis

Respuesta al
estrs bitico y
abitico

GST vegetales son una gran y diversa familia de genes con 25 miembros en soya, 42
maz y 54 en arabidopsis.
Son proteinas citoplasmaticas, se ha reportado isoformas microsomal, plastdica,
nuclear y apoplstica.
Son muy abundantes y a veces supera el 1% de las protenas solubles en vegetales.
GST acta como un regulador negativo de la respuesta de defensa.

Actividad GST

Hojas y races de plantas de


P. sativum y O. sativa expuestos Cd
Estrs salino en raices L. esculentum

Tabaco transgnico que


sobreexpresan GST y GPX, mayor
crecimiento en ambiente estresado.

ROS scavenging antioxidant defense mechanism


Glutatin peroxidasa GPX

Ayudan a cel. vegetales del estrs


oxidativo

Gran familia de isoez, utilizan diversas GSH para reducir H2O2 y hidroperxidos
orgnicos y de lpidos.

El estrs aumenta la actividad de GPX en plantas C. annuum pero disminuye en


races y no causa ningn cambio en hojas de P. sativum expuestos-Cd.
La sobreexpresin de GPX, mejora la tolerancia al estrs abitico en plantas
transgnicas

Se observ 30-60% Act. GPX en plntulas


transgnicas de G. hirsutum, no era diferente de la
actividad de la GPX en plantas WT en condiciones de
estrs salino.

Non-enzymatic antioxidants
o Acido Ascrbico (Vit C)

o Glutatin GSH

Todos los tejidos de la planta, mayor en


clulas fotosintticas y meristematicas.
30 a un 40% del total de ascorbato esta
en cloroplasto [50 mM].
Proporciona proteccin a las membranas
por compactar directamente el O2 y OH,
por regenerar a-tocoferol del radical
tocoferoxilo
Preservacin de las actividades de las
enzimas que contienen iones de metales
de transicin prosteticos

Mantencin
estado REDOX

o Localizada en todos los compartimentos celulares.


o La sntesis de glutatin se produce en dos pasos
dependiente de ATP.
o GSH desempea un papel clave en el sistema de
defensa antiox, regeneracin de ASH.

Alta [ ] GSH se correlaciona con la capacidad de


plantas a resistir el estrs oxidativo inducido por
metales

Non-enzymatic antioxidants
o Prolina (PR)
Potente antiox y potencial inhibidor de la
PCD.
Agente osmoprotector, estabilizador de
protenas, quelante de metales, inhibidor
de la LPO, eliminador OH y O2.
Acumulacin de Pro por estrs metlico,
salino y sequa (mejora tolerancia).

Mecanismo para aliviar la


acidosis citoplasmtica

o a-Tocoferoles (vit E)
Estrs ox. activa la expresin de
genes responsables de la sntesis
de tocoferoles .

Se localiza en la membrana de los tilacoides de


los cloroplastos.
4 ismeros tocoferoles (a-, b-, g-, d-)
(a- mayor Act.antiox- 3 grupos metilo)
Previene la etapa de propagacin de la cadena
de auto-oxidacin lipdica (trampa de radicales
libres efectiva).
Nitracin g-tocoferol, mecanismo para la
regulacin y desintoxicacin de NOx en tejidos
animales.

Non-enzymatic antioxidants
o Carotenoides (Car)
Fotoprotector, disipa el exceso de energa
de excitacin en forma de calor, elimina
ROS y suprime LPO.
Hay ms de 600 carotenoides presentes en
la naturaleza.

o Flavonoides
Flavonoles

Flavonas

Isoflavonas

Antocianinas

Se acumulan en la vacuola vegetal como


glucsidos, se producen como exudado en
hojas y otras partes areas.
Concentracin en clulas > 1 mM.

Funcones

Absorben la luz entre


400 y 550 nm (recoleccin)

Protegen el aparato
fotosinttico (antioxidante)
Montaje PSI, estabilidad protenas
complejas y memb. tilacoidal
(estructural)

Su capacidad antiox depende de los


potenciales de reduccin de los radicales
libres y la accesibilidad.
Aumento en niveles de flavonoides
despus estrs biticos y abitico.
Heridas, sequa, toxicidad por metales y
privacin de nutrientes

Conclusions

Diferentes tipos de estrs abitico provocan una sobreproduccin de


ROS (estrs oxidativo).
Afecta las propiedades de la membrana celular y causa dao
oxidativo a los cidos nucleicos, lpidos y protenas (no funcionales).

Mecanismos de defensa antioxidantes para desintoxicar los efectos


nocivos de ROS.
No enzimticos Pro, Car, Flavonoides, GSH, Vit C y E
Enzimticos
SOD, CAT, GR, GST, etc.

La sobreexpresin de SOD (Mn-SOD, Cu / ZnSOD, Fe-SOD), CAT, APX, GR, DHAR, GST y
GPX, mejora la tolerancia al estrs abitico en
varias plantas de (Eficiente capacidad para
eliminar ROS )