Cromatografa de lquidos

de alta resolucin
HPLC

Qu es Cromatografa Lquida de
Alta Eficiencia?
La

cromatografa de lquidos de alta

resolucin,
es
un
modo
de
cromatografa en la cual el proceso de
separacin y transferencia de masa es
entre la fase estacionaria y la fase
mvil y una temperatura dada.

 La

HPLC, representa una de las herramientas

ms empleadas en el laboratorio analtico
moderno.
La
cromatografa es un mtodo, usado
primariamente para la separacin de los
componentes de una muestra, en la cual los
componentes se distribuyen en dos fases.

Diferencias. Fase Mvil

Si

es un gas: Modalidad cromatogrfica gaseosa.

Si es un lquido: Cromatografa lquida.
Cromatografa

en capa delgada.
Cromatografa lquida en columna abierta.
HPLC.

Diferencias
HPLC y GC: Tipo de detectores y la influencia de la
fase mvil.
GC: se utiliza para separar mezclas que contienen
compuestos orgnicos voltiles.
En GC es muy simple encontrar detectores que
diferencien la muestra de la fase mvil.
En HPLC es ms difcil ya que la fase mvil no slo no
es inerte sino que su masa es sensiblemente superior.

Clasificacin de la
Cromatografa de Lquidos
Cromatografa

Lquido-Slido.(adsorcin)
Cromatografa Lquido-Lquido.(particin)
Cromatografa de Fase (normal y reversa)
Cromatografa de Intercambio inico.
Cromatografa de Exclusin por Tamao
(cromatografa en gel)
6

Fase Estacionaria
Si

la fase estacionaria es un slido y la fase

mvil un lquido la Cromatografa se denomina
CLS.
Anlogamente existirn una cromatografa CLL,
CGL y CG.
As, la Cromatografa puede clasificarse en
modalidades de afinidad y por tamao
molecular.
7

Clasificacin por Afinidad

Cromatografa

en fase normal.

Cromatografa

en fase ligada.

Cromatografa

de intercambio inico.
8

De Fase Ligada
Reemplazando

el tipo comn de unin de la fase

estacionaria a su soporte, hacindola perdurable
por medio de una unin qumica covalente.
Ahora las separaciones se efectan sobre
material qumicamente modificado, con un
amplio rango de polaridad y selectividad.

Intercambio inico
Se

emplean rellenos en los cuales

la partcula est constituida por un
polmero o por slica gel, en cada
caso unida a un grupo funcional
aninico o catinico.
10

Exclusin por Tamao

Emplea

materiales de porosidad controlada, que

funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las
molculas de la muestra segn un orden
decreciente de tamao molecular.

Si

se dispone de estndares apropiados, de peso

molecular adecuado, puede evaluarse el PM de
un compuesto desconocido.
11

Equipos

12

Clasificacin de Equipos

Integrados: Cada una de sus partes estn reunidas en un

gabinete y su intercambio o conexin con otros
componentes es difcil.

Modulares: Los mdulos son instrumentos individuales

que permiten no solo armar el equipo segn las
necesidades, sino aumentar su complejidad segn esa
necesidad vare.

13

Componentes principales

Solvente
Bomba de alta presin
Inyector
Columna
Detector
Graficador

14

Partes del cromatgrafo

En el caso ms simple, el cromatgrafo lquido est
constituido por:
Un reservorio de solvente que alimenta al sistema con la fase
mvil.
Un sistema para forzar el pasaje de la muestra por la columna:
Bomba.
Un sistema que permite la introduccin de la muestra: Inyector.
Un sistema de monitoreo de la solucin que emerge de la
columna: Detector.
Un sistema de registro de los datos proveniente del detector.

15

Diagrama Bsico de un sistema

de HPLC

16

Esquema

17

18

Bases de la separacin
Cuando

la fase mvil y la muestra son forzadas a

atravesar la fase estacionaria, se presentan
diferentes tipos de interacciones: hidrofbicas,
puentes de Hidrgeno, interacciones dipolares y
electrostticas, stas son responsables de la
mayor o menor afinidad de cada uno de los
componentes de la muestra por alguna de las
fases.
19

Separacin

20

Figura, 41 Explicar

21

La eficiencia de una columna cromatogrfica y,

por lo tanto, su poder separativo se mide en
funcin de su nmero de platos tericos.

Para lograr la separacin de dos componentes

dados, no slo deben eluir a distintos tiempos de
retencin, sino que el ancho de los picos debe ser
tan bajo como sea posible.

22

 Aspectos

tcnicos

23

Qu es Cromatografa Lquida
de Alta Eficiencia?
HPLC utiliza una fase mvil lquida para
separar los componentes de la mezcla. El
solvente trabaja a una presin de 6,000 psig
Los componentes o analitos deben ser
disueltos en un solvente y se pasan por la
columna cromatogrfica a altas presiones.
La resolucin depende de la interaccin entre
el soluto , los componentes y la fase
estacionaria.

24

Eleccin del Solvente

Caractersticas:
Disponible comercialmente
Precio
Pureza y Estabilidad. En la

actualidad
contamos con productos de calidad de pureza
cromatogrfica. Bajo contenido de impurezas.
Disolver la muestra
Miscible con otros solventes para formar
mezclas tiles
25

Elecccin del Solvente

Caractersticas:
No degradar o disolver la fase estacionaria
Tener baja viscosidad para reducir las cadas

de presin
Ser compatible con el detector utilizado.
Transparencia ptica (cuando se usan
detectores UV)
Se prefieren solventes de punto de ebullicin
intermedio.
26

Tipos de solvente

Name

MW

BP

I.R.

[C]

UV

Viscosidad

[nm]

[cP]

[Debye
]

Acetonitrile

41

82

1.341

195

.358

3.37

Dioxane

88

101

1.421

215

1.26

0.45

Ethanol

46

78

1.359

205

1.19

1.68

Methanol

32

65

1.326

205

.584

1.66

Isopropanol

60

82

1.375

205

2.39

1.68

Tetrahydrofuran

72

66

1.404

215

2.20

1.70

Water

18

100

1.333

185

1.00

1.84
27

Filtracin y Desgasificacin de
solventes
Las

partculas
pueden
ocasionar
costosos daos a la bomba HPLC, al
guarda columnas, y en general causar
desgaste del sistema de HPLC. Los
fabricantes de los instrumentos tienen
en cuenta este problema y recomiendan
que se filtre ( 0.45 o 0.22 micras) y
desgasifique los solventes HPLC antes
de usarlos.
28

Filtracin y Desgasificacin de
solventes
El

Oxgeno Disuelto puede producir mayor

interferencia
en
los
detectores
de
fluorescencia y electroqumicos.
El Nitrgeno Disuelto es el otro componente
de la atmsfera que puede producir burbujas
en la columna de HPLC y cuando el solvente
entra al detector produce picos falsos y
desviaciones de la lnea base.
El Dixido de Carbono disuelto algunas
veces puede ser la causa de los cambios de
pH en el sistema de solvente
29

Mtodos de Filtracin de
Solventes en HPLC
Hay

tres(3) mtodos comunes que

se utilizan hoy para la filtracin
previa de los Solventes en HPLC :
Filtro

a la Entrada del Solvente

Filtracin al Vaco
Filtracin en Lnea

30

Mtodos de Desgasificacin de
Solventes en HPLC
Existen

cuatro mtodos comunes usados

para desgasificar solventes en HPLC previos a
su uso:
Sonificacin
Burbujear

Helio
Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo
Desgasificacin al Vaco en Lnea
Temperatura

31

Preparacin de fase mvil

Ajuste

de pH, parmetro critico en la retencin de

solutos ionizables ( medir antes de dosificar
modificador orgnico)
El pH de la solucin aumenta con la
incorporacin de un modificador orgnico.
A valores pH mayores de 7.5 disolucin de slice (
sangrado)
A pH menor a 2 se hidroliza la unin entre la slice
y la fase enlazada.

32

Bombas
Requisitos o aspectos ms importantes
que debe reunir una bomba o sistema
de bombeo:
Debe producir presiones estables hasta
6000 psi.
Mantener el flujo libre de pulsaciones
Generar intervalos de caudales de flujo
(0,1 a 10 ml/min).
33

Bombas

Control

y reproducibilidad del flujo de

solvente
Componentes de la bomba resistentes a
la corrosin

34

Bombas
Las

bombas que se usan en HPLC se

pueden clasificar segn su
funcionamiento y diseo en:
Mecnicas
Recprocantes
De desplazamiento contnuo
Neumticas
35

Bombas
Principio de la bomba reciprocante

36

Bomba w 600
Velocidad

de flujo (0.01 a 0.5 ml/min, 0.1 y

mayores con presin de 0 hasta 6000 psi
Exactitud de flujo 0.5 % +/- 1.0 %
Precisin +/- 0.1 % a 0.3 %
Ruido : pulsaciones en intervalos de tiempo
Deriva: cambios en intervalos de tiempo

37

Programacin del Solvente

Existen

dos mtodos de programacin de Solvente

en HPLC:

Isocrtico

Gradiente de Elucin. Es un trmino que se

utiliza para describir el proceso mediante el cual
se cambia la composicin de la fase mvil.
Pueden efectuarse de dos maneras:
A
A

baja presin
alta presin

38

39

Sistemas de Inyeccin de
muestra
Estos

sistemas han variados durante la

historia del sistema de HPLC, en un
principio de utilizaba la inyeccin de la
muestra con jeringas de alta presin
cuales ya estn de desuso. Hoy se
utiliza el sistema de Vlvulas inyectoras

40

Sistemas de Inyeccin de
muestra
Generalmente

se usa una vlvula

muestreadora con jeringa.

41

 Vlvula

muestreadora

42

Columna
Actualmente

todas las columnas son

de acero inoxidable 316 con
dimetro interno de 2.6 a 3 mm o 4.6
a 5 mm , casi todas con un dimetro
externo de de pulgada

43

Fase estacionaria
Principales

parmetros de la fase

estacionaria

Tamao

de partcula: 3 a 10 m
Distribucin de partcula : con una
desviacin mxima del 10 %
Tamao de poro : 70 a 300 ;
rea superficial : 50 a 250 m2/g
Densidad de la fase (numero de sitios activos
por unidad de rea): 1 a 5 por 1 nm2
44

La tabla que se muestra presenta los parmetros principales de algunos

adsorbentes comerciales
Vporo Dporo

rea
Sup.

Distribucin de
partcula

densidad
de la fase

ml/g

m2/g

M/m2

IB-Sil Phen.

0.75

125

165

5.5

2.74

Hypersil C4 (3)

0.6

300

50

2.0

4.80

Supelcosil C8 (3)

0.6

100

170

8.5

Spherisorb C8

0.5

80

220

6.0

2.51

Novapak C18

0.3

60

120

7.0

3.0

IB-Sil C18

0.75

125

165

11.0

3.27

Spherisorb C18

0.5

80

220

12.0

2.72

Prodigy C18

1.17

150

310

18.7

3.30

Inertsil C18

1.1

150

320

18.5

3.23

Hypersil C8

0.7

120

170

7.0

3.85

Hypersil C18 (3)

0.7

120

170

10.0

2.84

Selectosil C18

0.9

300

110

7.0

2.93

Nombre

45

Columna
Fuentes

HPLC:

de dao de una columna de

Obstruccin por partculas pequeas en

los solventes o fases mviles
Obstruccin por materiales no eludos en
las muestras
Variacin de las caractersticas de
retencin por incremento de materiales
no eludos

46

Detectores

47

Deteccin

La eficiencia de un detector cromatogrfico depende

de la relacin entre la cantidad fsica medida y la
composicin del efluente, as como tambin de las
caractersticas de las seal de transferida.

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:

Detectores basados en una propiedad de la fase mvil
. Ejemplo: Detector de Indice de Refraccin
Detectores basados en una propiedad de la sustancia
a separar.

Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector

Ultravioleta

48

Deteccin
Detector

UV. Hay bsicamente tres tipos:

Detector de Longitud de Onda Fija

Detector de Longitud de Onda Variable
Detector de Arreglo de Diodos

49

Deteccin
Detector

UV. Hay bsicamente tres tipos:

Detector de Longitud de Onda Fija

El espectro se divide en :
infrarrojo (IR)
2,500 - 50,000
Infrarrojo cercano
800 - 2,500
Visible
400 - 800
Ultravioleta (UV)
190 - 400 nm

50

Deteccin
Detector

de ndice de Refraccin.
Existen muchos diseos de estos
detectores, pero solamente existen
ahora dos tipos:
Tipo Deflexin
Tipo Fresnel

51

Deteccin

Detector

de Fluorescencia.

Este detector solamente puede detectar

compuestos que tengan fluorescencia
nativa o inducida por derivatizacin .
Detector

de Fluorescencia Inducida por

Laser
Segn la Fuente de Excitacin
Segn el sistema ptico

52

Catlogo
Revisar

catalogo

Preparacin de la muestra
Caractersticas de columnas
Aplicaciones especificas

53

Problemas ms comunes
encontrados en HPLC
Esta

es una lista de los problemas

normalmente encontrados en HPLC, sus
posibles causas posibles, y cmo
solucionarlos.
Presin Alta
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o
Guarda Columna por partculas.
Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente,
teniendo la columna desconectada del detector. Si esto no
funciona reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si
la presin sigue alta reemplace la columna.
Solucin a largo plazo: Asegurase que todas las fases mviles
se filtren apropiadamente antes que entren a la bomba de
HPLC . Tambin filtre todas las muestras antes de
inyectarlas.
54

Problemas ms comunes
encontrados en HPLC
Prdida

de la Resolucin

Posible causa: Obstruccin de la Columna

de HPLC del Guarda Columna por
partculas.
Solucin: vea la seccin de Presin Alta
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes de
que se introduzcan las fases mviles en el
sistema de HPLC.

55

Problemas ms comunes
encontrados en HPLC
Picos

Hendidos

Posible causa : Obstruccin de la Columna

de HPLC o del Guarda Columna por
partculas.
Solucin: La columna se desatornilla. Si es
necesario reemplazar la columna.
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes
que se introduzcan las fases mviles en el
sistema de HPLC.

56

Problemas ms comunes
encontrados en HPLC
Variacin

en los Tiempos de Retencin

Posible causa : Aire atrapado en la bomba

debido a gases disueltos en fase mvil.
Solucin: Degasificacin de la Bomba
Solucin a larga plazo: Asegurase fase
mvil este propiamente y adecuadamente
desgasificada. Si usa desgasificacin
electrnica en la lnea asegurarse de que la
cadencia del flujo no es demasiado alto.

57

Problemas ms comunes
encontrados en HPLC
Variaciones

de la Lnea Base

Posible causa: Burbujas del aire atrapados

en la celda del detector debido a una mala
desgasificacin de los solventes de la fase
mvil.
Solucin: Asegurese que todas las fases
mviles estn debidamente desgasificadas y
considerar el uso de un restrictor de la
presin a toma de corriente del detector.
58

Problemas ms comunes
encontrados en HPLC
Lnea

Base con mucho Ruido

Posible causa: Aire atrapado en celda del

detector o en la bomba.
Solucin: Enjuage el sistema y purge la
bomba de HPLC . Use Solventes
desgasificados adecuadamente para
mantener constante la velocidad de flujo de
la fase mvil del sistema.

59

Problemas ms comunes
encontrados en HPLC
Picos

Falsos (Detectores Electroqumicos y de

Fluorescencia)
Posible causa: Oxgeno Disuelto
Solucin: Desgasificar adecuadamente las
fases mviles para reducir la concentracin
de oxgeno disuelto.
Solucin a largo plazo: Agregar un sistema
de filtracin al vaco en lnea.
Peridicamente chequear el nivel de
oxgeno disuelto.
60

Problemas ms comunes
encontrados en HPLC
Baja

Ninguna Presin

Posible causa: Trabajar con bombas, sellos

pistones expuestos por mucho tiempo a
partculas en suspensin en la fase mvil.
Solucin: Reemplace los sellos o pistones, si
es necesario.

61