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Las diferencias intrnsecas entre los

queratinocitos orales y de la Piel


Intrinsic Differences between Oral and Skin Keratinocytes
Anna Turabelidze, Shujuan Guo, Allison Yen Chung,Lin Chen, Yang Dai,Phillip T. Marucha,Luisa A DiPietro
Publicado: 08 de septiembre 2014

Dra. mbar Surez


Dermatologa

Introduccin
Los queratinocitos representan el 90% de las clulas de la epidermis
Un aspecto importante de la cicatrizacin de heridas es la
reepitelizacin
Despus de una herida en las inmediaciones ocurre proliferacin y
migracin de queratinocitos para una reepitelizacin efectiva
Los estudios realizados por este grupo de investigadores han
demostrado que heridas orales muestran una menor respuesta
inflamatoria e infiltracin de clulas, en comparacin con las
cutneas
Existen diferencias en la expresin citoquinas inflamatorias
La produccin de Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF),
un mediador de la angiognesis dominante de la herida, es
significativamente menor en forma queratinocitos orales frente a
heridas de la piel, y la angiognesis en las heridas orales es menor
que en la piel

Introduccin
Han descrito previamente la expresin gnica en la piel y las
heridas de la mucosa a travs de todas las etapas de la cicatrizacin
de heridas
Utilizando la tecnologa de microarray, han mostrado que, aunque
los patrones de expresin son similares en ambos tejidos, durante
la curacin no son idnticas
Especficamente, el patrn de expresin genmica de la respuesta
de la lesin de la mucosa oral, suele ser ms rpido, ms corto en
duracin, y de menor intensidad que la respuesta de la piel
Una explicacin para esta diferencia es la variacin ambiental de
dos sitios, como la temperatura, el flujo de saliva, o microflora
Sin embargo, estudios han demostrado que la cavidad oral
mantiene sus caractersticas morfolgicas intrnsecas

Objetivo
Hasta la fecha, hay pocos informes que
describen las diferencias en la expresin gnica
en los queratinocitos de diferentes lugares
En el estudio actual:
Identificacin de las diferencias inherentes
clave entre los queratinocitos orales y de la
piel que median el cierre de heridas

Metodologa
Aprobado por la comisin de tica
Comisin de cuidado y empleo de animales de la
Universidad de Illinois
Consentimiento informado para donantes voluntarios
(adultos sanos 18-35 aos)
Muestras de piel sana de brazo y paladar duro
(2mmX10mm)

Queratinocitos de ratn para el anlisis de microarrays


4 ratones (6-8 sem de vida)
Ratones hembra Balb (Harlan Inc., Indianapolis, IN) fueron
sacrificados
Epidermis de la piel se obtuvieron de la cola de los ratones,
y los tejidos orales epidrmicas del paladar duro

Metodologa
Preparacin de ARN total
ARN total extrado usando
Trizol y se purifico (Kit
Rneasy)

Aislamiento primario de los queratinocitos


Piel humano de brazo y de
paladar duro.
Lavados en OH 70%

PBS: 50 mg/ml de gentamicina


0,5 mg/ml de anfotericina B
Incubacin por 2 hrs: Dispasa al
0,2%. Separacin del epitelio

La integridad (18S / 28S) y las


concentraciones de ARN se
determin
utilizando
un
Experion

Incubo por 10 min a 37 C con


triptasa al
0,05% y EDTA
0,53mM
Neutralizo con Inh de triptasa
Placa de Petri (1 10 5 cel)
Cultivaron

Metodologa

Anlisis de microarrays

Un formato experimental, basado en la sntesis o fijacin de sondas, que representan los


genes, sobre un sustrato slido, expuestos a las molculas diana (la muestra)
Affymetrix GeneChip genoma

Proceso de hibridacin

Probesets (sondas)

CHIP de ADN a la cual se unen


fragmentos de ADN (muestra)
Se usa en anlisis de expresin
diferencial de genes (grupo de
secuencias, 10000 o 50000 veces)
Fluorescencia o nivel d expresin de
genes
Tasa de falso descubrimiento (FDR) de
<0,05 para identificar las diferencias
significativos en la
Depositando el mRNA marcado del tejido a posicionales
estudiar sobre cada chip
expresin gnica

Metodologa
In vitro: ensayo de proliferacin
Raspado 75-80% monocapa de
queratinocitos (4x4 araazos)

reas fotografiadas: 0,6 y 24


hrs
Conteo del nmero de clulas
Ensayo de proliferacin
CellTiter96 Aqueous One
Solution Cell
(colorimtrico): 0,24 y 48 hrs

En vitro: migracin de queratinocitos


Ensayo de migracin
fagocintica sal de oro, que fue
descrita por primera vez por
Albrecht-Buehler en 1977
Evalua directamente la
motilidad de queratinocitos sin
posibilidad de confusin de la
proliferacin celular
Medicin
de
migracin
mediante
el
software
ScionImage (Maryland)

Clulas eran visibles como


espacios vacos negro contra el
fondo de brillantes partculas de
oro y sal

Metodologa
Anlisis de RT-PCR

Un microgramo de RNA total de cada muestra fue sometida a la


sntesis de la primera hebra de ADNc utilizando M-MLV
transcriptasa reversa (Ambion) y cebadores de VEGF humano

Para estudiar la respuesta a los estmulos de los queratinocitos, las clulas


subconfluentes fueron tratados con IL-1, IL-6 y DMOG durante 24 horas, se aisl el
ARN total, y la PCR en tiempo real se realiz segn las instrucciones del fabricante
(Applied Biosystems).

Metodologa
Anlisis estadstico
Software GraphPad (GraphPad Software, San Diego, CA)
Todos los datos se expresan como media el error
estndar de la media (SEM)
Dos vas ANOVA se utiliz para evaluar los datos agrupados
Prueba de Bonferroni para determinar las diferencias entre
los grupos
Las comparaciones se consideraron estadsticamente
significativas cuando p <0,05
Student t -test P <0,05 fue considerado estadsticamente
significativo.

Resultados
Figura 1. La agrupacin jerrquica de los
genes expresados ms de A) 10 veces y B)
de 50 veces en el epitelio oral y de la piel

Un total de 13710 genes fueron


expresados diferencialmente entre las
clulas epiteliales y orales
107 mostraron ms de 10 veces la
expresin en el epitelio oral en un
umbral de FDR <0,01.
216 genes fueron ms de 10 veces
expresado en el epitelio de la piel en el
mismo umbral
El mapa de calor indica la expresin
gnica en la piel y en el epitelio oral es
significativamente diferente
La clave de color muestra la asignacin
de color para el valor de la intensidad
de expresin.
FDR <0,01, N = 4

Anlisis de microarrays

Resultados
Tabla 1. Molculas expresadas diferencialmente relacionados con el movimiento celular y la
proliferacin

En un umbral de significacin de FDR <0,01, varios genes de proliferacin y migracin


asociada se expresaron ms alta en el epitelio oral en comparacin con epitelio de la piel
Estos hallazgos implican diferencias especficas de tejido inherentes en la capacidad
proliferativa y migratoria como contribuyentes a la respuesta diferencial a la cicatrizacin
de heridas en la piel y las mucosas

Resultados
Figura 2. Queratinocitos oral y de la piel, cierre
de la herida In Vitro posterior a rascarse

Se cont el nmero de clulas en el rea


inicial despojada

Nmero de celdas 6 horas despus de


rascar: 83,4 10,9 orales vs piel 23,8 6,4
Nmero de clulas 24 horas despus de
rascar: 317,3 24,8 orales vs 118,0 37,6
piel (P <0,01)

Resultados
Figura 4. Comparacin de la piel y la proliferacin de queratinocitos
oral In Vitro de la herida

La proliferacin de los seis cultivos de queratinocitos independientes tanto de las


clulas derivadas de la piel y orales fue examinado en los puntos de tiempo de 0,
24,48 horas despus de la nada
La proliferacin de los queratinocitos orales era modesta, pero significativamente
ms rpido que los queratinocitos de la piel a las 24 horas

Resultados
Figura 5. Comparacin de la piel y la migracin
de queratinocitos orales por Gold-coloidal
ensayo de migracin
B) Queratinocitos piel MI 5.1 1.5 y
queratinocitos orales MI 13,0 2,7,
respectivamente

La cuantificacin de la migracin ha
demostrado que los queratinocitos orales
migran a una tasa promedio que es 2.6
veces ms rpido que los queratinocitos de
la piel

Resultados

Figura 6. VEGF, IL-15, y la expresin AKT3 en la piel y


queratinocitos orales tratadas con IL-1, IL-6, y DMOG
(HIF 1 estimulante)

Para probar la hiptesis de que


los queratinocitos orales y la piel
tienen respuesta diferencial a la
lesin, se estimularon con una
dosis estandarizada de IL-1 o
IL-6
Para imitar la respuesta a la
hipoxia, un disparador
importante en la herida, los
queratinocitos se expusieron a
dimethyloxalyglycine (DMOG),
un agente que aumenta la
actividad del factor inducible por
hipoxia e imita las condiciones
de hipoxia intracelulares
Evaluacin por PCR tiempo real

Discusin
Los resultados actuales sugieren que la
reparacin es superior en mucosa oral, soportado
por las caractersticas intrnsecas del epitelio
La observacin de que 13710 genes se expresan
diferencialmente entre los dos tejidos fue
inesperado, ya que los tejidos comparten muchas
caractersticas histolgicas y funcionales
Este hallazgo de que los perfiles de expresin
gnica del epitelio oral y de la piel son bastante
diferentes sugiere que tales diferencias pueden
ser crticos para su funcin

Discusin
Varios genes expresados diferencialmente pueden
influir en la migracin de queratinocitos y la
proliferacin. Por ejemplo, la expresin de Pitx2, una
protena que apoya la migracin y la proliferacin, se
observ a ser mayor en los queratinocitos de la mucosa
oral
AHSG, que se expresa en altos niveles por los
queratinocitos orales, se ha informado que aumenta la
migracin de queratinocitos
Estos datos demuestran la constelacin de protenas
que regulan la capacidad migratoria es muy diferente
en los queratinocitos de la piel y la mucosa

Discusin
Mientras que los estudios anteriores han informado que la
mucosa oral tiene una tasa de proliferacin ms alta que la
piel , nuestros resultados son los primeros en comparar la
proliferacin de queratinocitos oral y piel humana
independiente de su tejido conectivo subyacente y el
medio ambiente
Estos datos sugieren que las clulas epiteliales orales
tienen una capacidad proliferativa intrnseca mayor que la
piel que es independiente de la modulacin por el tejido
conectivo subyacente (matriz extracelular)
Demostramos que los queratinocitos orales migran 2,6
veces ms rpido que los queratinocitos de la piel
Despus de la aadir IL-1 y tratamiento DMOG, la
expresin de VEGF y IL-15 mostr una mayor regulacin en
la piel que en los queratinocitos orales

Discusin
Los queratinocitos orales y de la piel
responden de manera diferente a los
estmulos (IL-1 IL-6, y la hipoxia)
Despus de la aadir IL-1 y tratamiento
DMOG, la expresin de VEGF y IL-15 mostr
una mayor regulacin en la piel que en los
queratinocitos orales

Conclusiones
El patrn general sugiere que los queratinocitos de la
piel presentan una respuesta ms robusta a las lesiones
que los queratinocitos orales
Esto puede ser el resultado de que los queratinocitos
orales tienen un perfil de expresin gnica ms
ventajoso que permite una respuesta ms rpida o
controlada a una lesin
Se necesitan estudios adicionales para identificar las
diferencias crticas que conducen a una mayor
proliferacin y la migracin en los queratinocitos de la
mucosa oral, en comparacin con los de la piel

Gracias!