Identification, analyse et squenage

de dADN recombinant
Squenage dADN
La caractrisation fine dun gne passe par son
squenage la connaissance de la composition et de
lordre des nuclotides qui le composent.
Techniques de squenage:

Maxam et Gilbert squenage chimique;

Sanger squenage enzymatique par incorporation
de didoxinuclotides (ddNTPs);

Le squenage sur puces technique davenir pour la
biologie clinique.
Hybridation molculaire
Lhybridation molculaire permet de reprer ou
de rechercher une molcule dADN ou dARN
spcifiques dans une population htrogne.

Les techniques dhybridation reposent sur:
le proprits physico-chimiques des acides
nucliques comme la complmentarit des bases
constitutives de lADN et de lARN;

la rversibilit du processus de sparation des
deux brins dune molcule dADN (dnaturation) et de
r-association (renaturation).
Dnaturation thermique de lADN
Courbe de dnaturation thermique de lADN
La fusion de lADN se droule pour une gamme troite de
tempratures. La temprature correspondant la moitie de
laugmentation de labsorbance est reprsente par Tm.
Mthode Maxam et Gilbert squenage chimique
(a)
Principe mthode Sanger - la raction chimique

squenage enzymatique
par incorporation de
dsoxyribonucliques
(ddNTPs)
Mthode Sanger squenage enzymatique par
incorporation de dsoxyribonucliques (ddNTPs)
Sont ralises quatre
ractions de polymrisation
Principe de la
mthode
Sanger
Mthode Sanger
Autoradiographie
Principe du squenage automatique
Diffrents types de
polymres
utilises en squenage
automatique
Comparaison entre
les ractions de
squenage
sans/avec marquage
par un fluorophore
Squeneur
ABI Prism 310

Types danalyses
Figure 1.23x Two examples of DNA technology
Figure 1.23x1 Biotechnology laboratory
Figure 1.23x2 Analyzing DNA
Secvenierea ADNr
16S o modalitate de
identificare fiabil
Principiul identificrii prin
secvenierea ADNr-16S
Toate microorganismele posed
cel puin o copie a genelor care
codific pentru ARNr. Regiunea
numit ADNr-16S este
majoritar folosit pentru
determinarea genului i speciei
prin PCR
Secvenierea ADNr-16S bacterian :modalitate de
identificare fiabil
Metoda permite :
Identificarea oricrui tip de germen
Spre deosebire de tehnicile clasice, aceast metodologie nu
necesit cunoaterea caracteristicilor germenilor studiai, sufucient-
izolarea unei simple colonii
Identificarea de germeni "stresai sau leni
Graie PCR-tehnic care poate fi aplicat pe microcolonii
bacteriene.
Identification genului i speciei germenilor "dificili "
Anumii germeni pun probleme de identificare prin tecnicile
clasice (ex:Pseudomonas spp.,Legionella ). Secvenierea ADNr-16S
permite depirea acestei dificulti.
Identificarea de germeni "atipici"
Numeroi germeni din mediu evolueaz i sunt "atipici".Tehnicile
clasice nu permit identificarea, secvenierea ADNr-16S devine metoda
preferat pentru analiza acestor tulpini
Studiul speciilor genului Pseudomonas
Secvenierea unei colonii isolat de Pseudomonas spp.
Comparaie (BLAST) ntre secvena obinut cu ansamblul secvenelor ADNr-
16S stocate n bancile de date
Figure 20.9 Using restriction fragment patterns to distinguish DNA from different
alleles
Figure 20.10 Restriction fragment analysis by Southern blotting
Figure 20.11 Chromosome walking
Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 1)
Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 2)
Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 3)
Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 4)
Figure 20.13 Alternative strategies for sequencing an entire genome
Table 20.1 Genome Sizes and Numbers of Genes
Figure 20.14a DNA microarray assay for gene expression
Figure 20.14b DNA microarray assay for gene expression